技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法。

背景技术

基因组中除了四个经典碱基外，还包含经过化学修饰的DNA碱基。这些修饰的碱基可以由内源酶或外源因子产生，它们有可能深刻影响基因组功能和细胞过程。已经发现了许多修饰的DNA碱基，其中哺乳动物基因组中最著名的是5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)及其氧化衍生物5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5-hmC)，5-氟胞嘧啶(5-formylcytosine，5-fC)和5-羧基胞嘧啶(5-carboxylcytosine，5-caC)。这些表观遗传标记已被证明在调节基因表达中起重要作用。DNA的甲基化修饰自1948年被发现以来,一直都是表观遗传领域的研究热点。DNA的甲基化修饰赋予了DNA双链除蛋白质编码信息外的表观遗传记忆，对基因组稳定性、基因表达和发育具有深远的影响。在2014年研究人员首次报道了TET酶可以氧化胸腺嘧啶变成5-hmU，这一结果揭示了胸腺嘧啶(T)的氧化产物(5-hmU、5-fU、5-caU)可能存在着一定的表观学意义。

5-hmU是在各种生物的基因组中鉴定出的胸腺嘧啶衍生物。在哺乳动物中，5-hmU是通过复制后加工机制形成的，这些机制包括通过一个10-11易位酶(TET)或活性氧(ROS)和5-hmC脱氨基的胸腺嘧啶羟基化。不过基因组DNA中修饰碱基的水平受许多因素的影响，例如细胞或组织的类型以及生物的疾病状态。mES细胞中5-hmU的大部分由TET酶氧化酶产生，而5-hmC的脱氨或ROS途径很少。因此，匹配的5-hmU：A而非错配的5-hmU：G是哺乳动物基因组中5-hmU的主要存在形式。当前已经有研究表明5-hmU几乎没有胸腺嘧啶残基的组成，例如在mES细胞中5-hmU约占0.00005％，丰度仅为5-hmC的0.1％。这就使得对hmU的分析变得十分困难，并且5-hmU和5-hmC之间的结构相似性也阻碍了对这些修饰的区分。因此，需要一种有效的标记DNA上5-hmU的方法，以进一步识别和联合检测、探索其生物学功能。

当前DNA样品中5-hmC的检测方法是通过化学氧化将5-hmU转化为5-fU，来检测基因组5-hmU。通过在聚合酶延伸反应过程中形成5-fU：G碱基配对，两种诱导的T到C碱基发生变化。但是，这种诱导变化的效率较低，即使在优化条件下，这种碱基改变的比例也低于40％，并且无法使用功能标签标记5-hmU。

此外，还有其他5-hmU的检测方法。有研究表明醛基修饰的尿嘧啶(5fU)可能在表观遗传学中也会起到一定的作用，例如在引入碱基错配，改变DNA的结构等。传统的5fU-DNA链的合成主要通过Pt催化氧化、锇氧化、高碘酸钠氧化等，由于其使用的催化剂剧毒限购，对设备要求高，使得很长时间5fU-DNA合成没有显著的突破。为了解决这一问题，研究人员设计合成一个生物素化的探针，该探针偶联有生物素，可以在后期应用于生物素-亲合素系统(Biotin-Avidin—System,BAS)，实现对5fU的选择性富集。然而，这种方法也对基因组DNA中存在的其他带有醛基的组分具有很高的反应性。

因此，需要有一种有效的标记DNA上5-hmU的方法，以进一步识别和联合检测、探索其生物学功能。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，该方法解决了现有技术中检测样品需求量大、化学反应条件苛刻、反应效率低等问题。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种DNA上5-羟甲基尿嘧啶的特异性标记方法，利用从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离出的5-hmU激酶实现γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶；然后，通过液相色谱-串联质谱法对产生的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶进行表征，并利用交联化学标记巯基对DNA上的5-羟甲基尿嘧啶实现特异性标记。

本发明所用的5-hmU是从铜绿假单胞菌噬菌体M6中分离得到的激酶，直接购买得到。

优选地，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶的具体操作如下：

1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列的dsDNA寡核苷酸作为5-hmU激酶的底物；

2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对位点的dsDNA模型底物；

3)将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育进行链置换反应；

4)采用5-hmU激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。

进一步优选地，步骤1)中，用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列为5'-CCAXGG-3'，其中，X＝T，U，hmU和fU。

进一步优选地，步骤2)中，不同碱基对包括：

5hmU：A，5hmC：G，5fC：G，5fU：A，U：A或T：A。

进一步优选地，步骤4)具体操作如下：

向样品中加入10U 5-hmU激酶和1mM ATP-γ-S，在浓度为1×的Cutsmart缓冲液反应体系中，在37℃，300rpm条件下振荡反应2小时，然后将微凝胶用1x PBS洗涤3次，得到5-硫代磷酸甲基尿嘧啶。

优选地，利用交联化学标记巯基的具体操作如下：

通过加入不同的巯基反应性试剂(碘酰-炔基、卤代乙酰基和马来酰亚胺等)与硫代磷酸酯基进行巯基反应，对不同5-hmU位点进行特异性识别和标记，以在同一基因组DNA样品或者单个细胞中区分5-hmU。

进一步优选地，巯基反应在37℃、避光条件下反应1h。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明利用铜绿假单胞菌噬菌体M6的5-hmU DNA激酶(5-HMUDK)实现了γ-硫代磷酸酯从5-O-硫代三磷酸腺苷(ATP-γ-S)转移到5-hmU，产生5-硫代磷酸甲基尿嘧啶(5psmU)。通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对所产生的5psmU进行检测，随后通过交联化学标记巯基实现DNA上5-hmU的特异性标记。具体优势如下：

1)本发明所述的标记方法，能够进行选择性的5-hmU识别和标记，即可避免其他碱基化学修饰带来的误差，实现准确识别标记。

2)本发明所述的ATP-γ-S，是ATP依赖酶系统的底物和抑制剂,能被磷酸酶和大多数ATP酶水解，但是水解过程很慢。且一旦硫代磷酸酶被磷酸化，蛋白质就会对蛋白质磷酸酶产生抗性。ATP-γ-S是ATP中最远的那个磷酸基上的双键氧变成S原子，在5-HMUDK的作用下能够将γ-硫代磷酸酯转移到目标物，然后就可以对基因组DNA上的目标物进行识别和标记，提高分析的准确度与灵敏度。

3)本发明所述的5-硫代磷酸甲基尿嘧啶(5psmU)，是ATP-γ-S在HMUDK的作用下将γ硫代磷酸转移到5-hmU上所生成。随后通过交联化学标记巯基实现DNA上5-hmU的特异性标记。该反应是一种高产率、反应条件简单、反应速度快、原料和反应试剂易得的化学反应。

4)本发明所述的LC-MS/MS，因为气相色谱只能分离易挥发且不分解的物质，而液相色谱则把分离范围大大拓宽了，LC与高选择性、高灵敏度的MS/MS结合，可对复杂样品进行实时分析，即使在LC难分离的情况下，只要通过MS1及MS2对目标化合物进行中性碎片扫描，则可发现并突出混和物中的目标化合物，显著提高信噪比。

附图说明

图1为本发明的原理图；

图2为DNA的熔解曲线；

图3为核苷色谱图；

图4为标记后5-hmU的质谱。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

参见图1，为本发明的DNA 5-hmU的特异性标记方法的原理图，该方法利用5-HMUDK实现了γ-硫代磷酸酯从ATP-γ-S转移到5-hmU，产生5psmU；然后利用巯基反应性碘酰-炔基试剂与硫代磷酸酯基的巯基反应，实现5-hmU的特异性标记。具体地，包括以下步骤：

1)制备含有用于限制性核酸内切酶NcoI的识别序列(5'-CCAXGG-3'，X＝T，U，hmU和fU)的dsDNA寡核苷酸作为5-HMUDK的底物；

2)通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对(5hmU：A，5hmC：G，5fC：G，5fU：A，U：A或T：A)位点的dsDNA模型底物；

3)为了形成含5hmU：G的dsDNA，将含有5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育以进行链置换反应；

4)利用铜绿假单胞菌噬菌体M6的5-hmU DNA激酶使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基，制得5psmU；

5)加入巯基反应性碘酰-炔基试剂与硫代磷酸酯基的巯基反应，然后通过核酸酶和磷酸酶将dsDNA样品降解为核苷，通过LC-MS/MS检测得到的各个样品的核苷，完成不同碱基的区分。

实施例1：利用本发明所述5-hmU的特异性标记方法，实现不同碱基的区分。

制备含有不同碱基的dsDNA寡核苷酸序列(包含限制性核酸内切酶NcoI位点5'-CCAXGG-3'，X＝T，U，hmU和fU)，通过体外DNA聚合酶催化引物的延伸，制备包含不同碱基对(5hmU：A，5hmC：G，5fC：G，5fU：A，U：A或T：A)位点的dsDNA模型底物。

其中，为了形成含5hmU：G的dsDNA，将含5-hmU：A的dsDNA产物与G模板一起温育以进行链置换反应。通过5-HMUDK和SH反应试剂在模型DNA标记反应中表征产物。如图2所示为通过限制性核酸内切酶NcoI切割的DNA样品的熔解曲线，可以看到反应产物5psmU可以阻断NcoI对DNA的切割。

5-HMUDK使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：具体地，5-HMUDK使ATP-γ-S硫代磷酸化5-hmU：A中的5-hmU残基；向样品中加入10U 5-HMUDK和1mM ATP-γ-S，在浓度为1×的Cutsmart缓冲液反应体系中，在37℃，300rpm条件下振荡反应2小时，然后将微凝胶用1xPBS洗涤3次，得到5psmU；经过限制性核酸内切酶NcoI切割的DNA样品后，对样品进行色谱检测，结果如图3所示，从图3中可以看出，不同的液相质谱保留时间证明本发明所述方法对碱基对具有良好的特异性及选择性。

接着加入巯基反应性碘酰-炔基试剂与硫代磷酸酯基的巯基反应，向样品中加入100μM碘酰-炔基试剂，在37℃，黑暗条件下进一步反应1小时，完成对硫代磷酸酯基的巯基反应。

完成反应后通过核酸酶和磷酸酶将dsDNA样品降解为核苷，在分析之前，所有纯化的dsDNA样品都被核酸酶和磷酸酶降解为核苷，保证LC-MS/MS检测的准确性；通过LC-MS/MS检测得到的各个样品的核苷，分析结果完成不同碱基的区分。结果如图4所示，从图4中可以看出，标记后的质谱图及数据证明了本标记方法成功实现dsDNA样品上5-hmU位点的特异性标记。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。