技术领域

本发明是属于纳米材料制造和应用技术领域，具体涉及到一种叶酸靶向和响应契伦科夫辐射释放化疗药物的纳米胶束用于协同X射线的放疗增效。

背景技术

当前，放化疗在临床应用上仍是众多癌症患者的标准治疗策略，其可以实现局部病灶的有效控制，延长患者的生存期。且在放疗的过程中同步化疗，对治疗晚期直肠癌、宫颈癌、非小细胞肺癌以及头颈癌等癌症均具有良好的预后效果。但放化疗协同的治疗方式依然存在着明显的系统毒性，这主要是由于一般的化疗药物缺乏靶向富集能力，势必会对机体的正常组织和脏器造成损伤。临床上在制定治疗方案的过程中，不仅要达到对肿瘤细胞的预期杀伤效果，也要考虑治疗手段对正常组织的毒副作用。因此，如何将放化疗有机整合，增强化疗药物对肿瘤细胞的特异性杀伤，减少机体的毒副作用也是一个亟待解决的关键问题。

近年来，纳米载体在生物医学领域的广泛研究，为化疗药物的有效递送提供了一个良好的平台。首先，纳米载体可以通过共价偶联或静电吸附一类配体分子,如，叶酸、透明质酸和表皮生长因子(EGF)等，靶向肿瘤部位高水平表达的受体分子，实现化疗药物的靶向递送，提高瘤内的药物浓度，降低药物在其他组织和脏器的非特异性富集，减少机体的毒副作用。其次，纳米载体通过分子层面的设计，还能够特异性响应外源和内源性的刺激，定时定点释放包埋的化疗药物，增强药物作用的特异性，减少非靶点部位的药物释放，同样可以降低机体的毒副作用。其中，光作为一种外源性的刺激，分辨率高，可控性强，能够远程精确操控药物释放，对机体无创无害，是一种理想的刺激源，但光的组织穿透深度有限，这成为光控纳米载体发展所面临的主要障碍。

X射线是临床上常用的放疗辐射源，不受限于组织穿透深度，且在辐照中会产生一种短波长的蓝色辉光——契伦科夫辐射。阿霉素(DOX)是一种广泛使用的化疗药物，可用于治疗多种不同类型的癌症，但DOX的过度使用会造成明显的心脏毒性。常用的阿霉素(DOX)、紫杉醇以及顺铂等化疗药物，均具有较强的疏水性，限制了其体内的有效递送，生物利用率低。此外，因缺乏对肿瘤细胞的特异性，单纯的腹腔或静脉注射化疗药物，会引起机体强烈的毒副作用。

发明内容

为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于叶酸靶向和契伦科夫辐射响应的双特异性纳米胶束及其制备方法和应用。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种基于叶酸靶向和契伦科夫辐射响应的双特异性纳米胶束，该双特异性纳米胶束是以叶酸修饰的两亲性嵌段聚合物FA-PEG-PCL为纳米载体，自组装包载能够响应契伦科夫辐射的DOC(邻硝基苄基偶联十六烷基的DOX衍生物)，得到的纳米胶束NM/DOC。

优选地，该双特异性纳米胶束形貌规则，平均粒径≈181nm，颗粒分布均匀。

本发明还公开了上述基于叶酸靶向和契伦科夫辐射响应的双特异性纳米胶束的制备方法，包括以下步骤：

1)将DOC溶解于二甲亚砜中；

2)将两亲性嵌段聚合物FA-PEG-PCL溶液溶解于四氢呋喃中；

3)将上述两种溶液搅拌混合均匀，逐滴加入持续搅拌的超纯水中，然后充分搅拌直至挥发掉混合溶液体系中的四氢呋喃，得到混合液；

4)将混合液用超滤膜过滤后，经超滤洗涤，制得双特异性纳米胶束NM/DOC。

优选地，步骤1)中，DOC和二甲亚砜的料液比为1mg：(200～500)μL。

优选地，步骤2)中，两亲性嵌段聚合物FA-PEG-PCL与四氢呋喃的料液比为10mg：(1～2)mL。

优选地，步骤3)中，加入的超纯水与DOC的用量比为(10～15)mL：1mg。

优选地，步骤3)中，充分搅拌采用磁力搅拌器，转速为2000～8000rpm/min。

优选地，步骤4)中，超滤膜采用滤头为0.45μm的超滤膜；超滤洗涤采用截留分子量为10000的超滤膜洗涤三次。

本发明还公开了上述的基于叶酸靶向和契伦科夫辐射响应的双特异性纳米胶束作为抗肿瘤药物的载药试剂的应用。

本发明还公开了上述的基于叶酸靶向和契伦科夫辐射响应的双特异性纳米胶束作为抗肿瘤药物的增效剂的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过光敏基团硝基苄基偶联十六烷基的DOX衍生物(疏水性增强)，并将其包埋在叶酸修饰的两亲性聚合物(FA-PEG-PCL)中，制备出纳米胶束NM/DOC，NM/DOC可利用叶酸靶向肿瘤细胞，且进一步在X射线局部放疗的过程中，通过产生的契伦科夫辐射断裂光敏基团——硝基苄基，增加DOX的亲水性，触发药物释放。利用契伦科夫辐射作为纳米载体药物释放的光学刺激源，可以克服一般光源穿透深度受限的问题，并且能够实现放化疗的有效协同，且通过NM/DOC的主动靶向和响应释药增强化疗药物作用的特异性，大大降低对机体的毒副作用。

经本发明制得的双特异性纳米胶束NM/DOC，具有以下特性：

(1)NM/DOC纳米胶束在生理条件下具有较高的稳定性，能够保证包载的DOX在体内血液循环的过程中不会过早的非特异性释放；

(2)NM/DOC纳米胶束能够借助于表面修饰的叶酸分子主动靶向肿瘤部位，减少机体正常组织和器官的非特异性富集；

(3)在X射线局部放疗的过程中，NM/DOC纳米胶束能够特异性响应契伦科夫辐射，在靶点处释放DOX，在放疗的同时定点化疗。

附图说明

图1为本发明的NM/DOC纳米胶束的电镜照片；

图2为本发明的NM/DOC纳米胶束的粒径分布图；

图3为本发明的NM/DOC纳米胶束在PBS中不同时间点的粒径变化；

图4-1为NM/DOC纳米胶束(X射线处理)不同时间点透析液中DOX的荧光光谱；

图4-2为NM/DOC纳米胶束(X射线未处理)不同时间点透析液中DOX的荧光光谱；

图4-3NM/DOC纳米胶束的累积释药量；

图5为NM/DOC纳米胶束共孵育的Hela细胞，经X射线处理或未处理后的共聚焦显微镜照片；

图6为NM/DOC纳米胶束在体外协同X射线对Hela细胞的杀伤效果；

图7为通过ICG的荧光成像NM/ICG纳米胶束在体内的分布富集情况；

图8为各组小鼠肿瘤的生长曲线；

图9为各组小鼠的生存率。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下面结合附图对本发明做进一步详细描述：

本发明以叶酸修饰的两亲性嵌段聚合物FA-PEG-PCL为纳米载体，自组装包载可响应契伦科夫辐射的DOC，制得NM/DOC纳米胶束。NM/DOC纳米胶束形貌规则，粒径均匀，且在磷酸盐缓冲液中具有良好的稳定性，能够主动靶向肿瘤，并响应X射线放疗时产生的契伦科夫辐射，释放化疗药物DOX，达到放化疗协同增效，减少机体毒副作用的目的。

本发明所用的DOC为邻硝基苄基偶联十六烷基的DOX衍生物，参考文献：Photo-responsive Nanovehicle for Two Independent Wavelength Light-TriggeredSequential Release of P-gp shRNA and Doxorubicin to Optimize and EnhanceSynergistic Therapy of Multidrug-resistant Cancer，公开的合成方法。

DOC的结构式如下：

DOC的合成路线如下：

DOC的具体合成方法，包括以下步骤：

步骤1：将5-羟基-2硝基苯甲醇(2mmol)和733mg溴代十六烷充分溶解于20mL DMF中，随后再加入424mg碳酸钠(Na2CO3，4mmol)。上述混合液置于油浴锅中，80℃反应24h，接着真空蒸馏除去DMF，并将得到的混合物重新溶于双蒸水与乙酸乙酯的混合液中，用双蒸水洗涤油相(乙酸乙酯层)两次，之后在油相中加入适量的无水硫酸钠(Na2SO4)，干燥过夜。接着，旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到粗产物，最后，用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂，柱层析法纯化粗产物得到化合物1，化合物1为淡黄色的固体。

步骤2：将4-硝基苯基氯甲酸酯(148mg，0.73mmol)溶于5mL四氢呋喃(THF)，并加入到溶有化合物1(148mg，0.7mmol)和N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，256μL，1.47mmol)的2mL氯仿中，混合均匀后，将上述混合液置于室温下反应24h。之后，将反应后的产物浓缩，并重新溶于50mL乙酸乙酯中，接着，将溶有反应产物的乙酸乙酯用1M的磷酸(H3PO4)溶液洗涤3次，再用碳酸氢钠(NaHCO3)溶液洗涤2次，然后加入适量的无水Na2SO4干燥过夜，最后旋转蒸发除去溶剂得到粗产物。用乙酸乙酯/石油醚作为洗脱剂，柱层析法纯化粗产物得到化合物2，化合物2为白色固体。

步骤3：将盐酸阿霉素(50mg，0.086mmol)溶于6mL DMF中，之后再加入36μL三乙胺(Et3N，0.258mmol)和49mg化合物2(0.086mmol)，充分溶解后，将上述混合液置于室温下反应36h，之后真空蒸馏除去反应溶剂，得到粗产物。最后，用硅胶作为固定相，甲醇/氯仿(1:100～5:100，V/V)作为洗脱剂，柱层析法纯化粗产物，得到红色固体DOC。

1、制备NM/DOC纳米胶束

称取DOC 1mg，溶于200μL二甲亚砜(DMSO)中；称取FA-PEG-PCL聚合物10mg，溶于1mL四氢呋喃(THF)中；将上述两种溶液通过搅拌混合均匀(具体搅拌时间无特殊要求，混匀即可)，逐滴加入10mL持续搅拌的超纯水中，随后继续置于磁力搅拌器上(2000rpm/min)搅拌24h，挥发掉混合液中的THF。接着，将混合液用0.45μm的滤头过滤，并用超滤膜(MWCO：10000)超滤洗涤三次，收集所制备的纳米胶束，放于4℃冰箱保存备用。

将上述制备的纳米胶束经透射电子显微镜观测，发现其形貌规则，分散性良好，如图1所示。经动态光散射检测(如图2所示)可得其平均粒径约为181nm，颗粒分布均匀。如图3所示，经过连续多天的粒径监测，NM/DOC纳米胶束在PBS中的粒径无明显改变，表明其稳定性较好。NM/DOC纳米胶束能够响应X射线产生的契伦科夫辐射，释放化疗药物DOX。研究中将经X射线处理后的NM/DOC纳米胶束置于透析袋(MWCO，3500)中透析，在不同的时间点取样，同时补足相同体积的PBS，最后用荧光光谱仪检测所收集样品中DOX的荧光光谱。图4-1为X射线处理的实验组，而图4-2为不做处理的对照组，实验组中在不同时间点可以检测到强烈的DOX荧光，而对照组的荧光光谱则无明显改变，说明X射线(契伦科夫辐射)能够触发NM/DOC纳米胶束快速释放负载的DOX。进一步通过DOX的荧光强度计算并绘制出实验组和对照组的药物累计释放曲线(如图4-3)，经X射线照射后，NM/DOC的DOX累计释放量在96h后达到了40％左右，而对照组则只有不到10％。

释放的DOX能够快速进入细胞核，如图5所示，将NM/DOC与Hela细胞共孵育，4h后用8Gy的X射线辐照细胞，随后继续孵育4h。接着，经洗涤、固定和染色后，置于共聚焦显微镜下观察，在X射线处理过的细胞中，能够明显看到相当一部分DOX的红色荧光与细胞核的蓝色荧光重合，而在对照组的细胞核(蓝色荧光)中几乎没有出现DOX的红色荧光，表明NM/DOC纳米胶束具有较强的特异性，只有在X射线(契伦科夫)触发的情况下才能有效释放负载的DOX，且只有游离的DOX才能够快速进入细胞核。

2、体外、细胞和动物实验验证NM/DOC可以主动靶向肿瘤

本发明通过体外、细胞和动物实验证明所制备的NM/DOC可以主动靶向肿瘤，最重要的是能够在X射线放疗下，由于切伦科夫光的产生而特异性释药，实现放疗和化疗的有效协同，降低对机体的毒副作用。

2.1 NM/DOC在经X射线(契伦科夫辐射)触发释放化疗药物后，能够协同放疗，增强对肿瘤细胞的杀伤作用

研究中将NM/DOC纳米胶束与Hela细胞共孵育，4h后用不同剂量(0、2、4、6、8、10Gy)的X射线辐照细胞，随后继续孵育72h，接着用CCK8试剂盒检测并统计细胞的存活率。如图6所示，随着X射线放疗剂量的增强，Hela细胞的存活率不断降低，而在相等X射线放疗剂量下，同时孵育NM/DOC纳米胶束的细胞存活率更低，这表明NM/DOC纳米胶束经刺激释药后，可协同X射线的放疗作用，增强对肿瘤细胞的杀伤。

2.2 NM/DOC纳米胶束能够借助叶酸主动靶向肿瘤

研究中首先建立动物模型，并且为了便于体内追踪，用ICG替代DOC包埋于FA-PEG-PCL中，制备NM/ICG纳米胶束(与NM/DOC制备步骤相同)。尾静脉注射ICG或NM/ICG纳米胶束，用小动物活体成像系统监测药物在体内的分布情况。如图7所示，小鼠在注射ICG1 h后，药物主要分布在肝脏中，在24h后已基本被机体代谢清除，而对于注射NM/ICG纳米胶束的小鼠来说，药物能够在肿瘤部位有效富集，并且随着时间的增加，瘤内的荧光强度不断增强，在48h后达到最强，且在72h后，瘤内仍然保持着强烈的ICG荧光。这些结果表明小分子药物容易被机体代谢清除，而包载在上述纳米胶束中的药物，具有叶酸靶向的功能，可以高效富集于肿瘤部位。

2.3 NM/DOC纳米胶束能与X射线放疗有效协同，放疗的同时特异性触发化疗作用，增强对肿瘤的抑制效果

研究中将瘤体约为150mm3的荷瘤小鼠随机分为四组：(1)PBS组；(2)PBS+X-ray组；(3)NM/DOC组；(4)NM/DOC+X-ray组。DOC的注射剂量为5mg/kg，X射线的辐照剂量为8Gy，治疗过程中测量并统计小鼠肿瘤的大小变化情况以及生存期。如图8所示，单纯只注射NM/DOC，不能有效刺激包载化疗药物DOX的释放，使得NM/DOC组与PBS组一样，没有明显的抑瘤作用，而PBS+X-ray组中由于X射线的放疗作用，在一定程度上抑制了肿瘤的快速增长。NM/DOC+X-ray组中小鼠肿瘤的生长速率最慢，证明X射线放疗协同NM/DOC特异性化疗的抑瘤效果最为显著。从各组小鼠的生存期来看(如图9所示)，NM/DOC+X-ray组的小鼠在治疗47天后仍有80％的存活率，这同样证明了X射线放疗协同NM/DOC特异性化疗的治疗组合最为有效，可以大大延长小鼠的生存期。

综上所述，借助于纳米载体实现药物的靶向递送和响应性释放，是提高药物生物利用率和特异性的一种有效策略。叶酸是纳米领域常用的靶向修饰分子，其可以与肿瘤细胞表面高表达的叶酸受体结合，实现药物的靶向运输。而光是响应性纳米载体常用的外在刺激源，可控性强，能够有效触发载体内包埋药物的释放，但光的穿透深度有限，不能到达组织深处的病灶。X射线不受穿透深度的限制，且在放疗时会伴随着契伦科夫辐射的产生。因此，利用X射线产生的契伦科夫辐射刺激纳米载体释药，可以克服光穿透深度受限的问题，另外，也可以协同X射线的放疗作用，增强对肿瘤细胞的抑制效果。基于此，本发明通过光敏基团硝基苄基偶联十六烷基的DOX衍生物(疏水性增强)，并将其包埋在叶酸修饰的两亲性聚合物(FA-PEG-PCL)中，制备出纳米胶束NM/DOC。NM/DOC可利用叶酸靶向肿瘤细胞，且进一步在X射线局部放疗的过程中，通过产生的契伦科夫辐射断裂硝基苄基，增加DOX的亲水性，触发药物释放，将放化疗有机整合，且通过NM/DOC的主动靶向和响应释药增强化疗药物作用的特异性，大大降低对机体的毒副作用。

以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。