技术领域

本发明涉及一种功能性羊乳饮料的制备方法，特别涉及一种保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备羊乳活性饮料的方法。

背景技术

高血压是世界最常见的慢性病，是最大的流行病之一，也是心脑血管病最主要的危险因素。常用降压药物包括钙通道阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体阻滞剂(ARB)、利尿剂、α受体阻滞剂和β受体阻滞剂六类，其中血管紧张素转换酶抑制剂(ACEI)对于高血压患者具有良好的靶器官保护和心血管终点事件预防作用，且降压作用明确，对糖脂代谢无不良影响，是当今降压类药物中发展最快的一种。常用的ACEI类药物包括卡托普利、依那普利、贝那普利等，但这些合成的ACEI会引起许多不良反应，最常见的是持续性干咳。研究表明，天然来源的ACE抑制肽是蛋白质经酶分解而产生的一类具有ACE抑制活性的多肽类物质，通常含3-10个氨基酸，分子量在300-10000之间，可以快速通过消化粘膜进入血液循环，与ACE强效结合从而抑制其活性，起到降压的作用，因此又叫降压肽。部分益生菌的胞壁蛋白酶能水解乳蛋白释放出肽类，其中的一些短肽具有生物活性，如降血压，但目前还没有降血压的羊乳饮料。

拐枣又叫万寿果，学名枳椇，其多糖具有降血糖的功能，但目前拐枣多糖制备存在纯度低的问题，主要杂质为单糖和双糖，因此去除单双糖和保留多糖是制备高纯度拐枣多糖的关键问题。

陕西省是我国传统的奶山羊主产区，关中地区是◻◻最大的奶山羊良种生产基地。2015年底全省奶山羊存栏180万多只，羊乳产量50万余吨，羊奶粉市场份额达95％以上，奶山羊数量、羊乳产量及羊奶粉产量均为◻◻第一，但国内羊乳产品的品种少，主要为羊奶粉及液态羊奶，其中大部分羊奶粉作为工业原料销往国外，存在产品科技含量低、附加值不高及同质化严重等问题，国外羊乳产品种类多，主要包括发酵羊乳产品(如奶酪、脱脂酪乳或酸羊奶)、冷冻产品(如冰激凌或冷冻酸羊奶)、液态奶、黄油、功能性羊奶片等。因此，开发羊乳新产品很有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有降血压、降血糖和防龋齿的保健功效的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备羊乳活性饮料的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

1)保加利亚乳杆菌培养基制备:

将乳糖15-25g、酵母粉15-25g、硫酸锰10-20mg、吐温80 0.5-1.0mL，水苏糖1.5-2.5g、蛋白胨4-6g、磷酸氢二钠4-6g、谷氨酸5-10mg、丙氨酸5-10mg添加到纯净水中，定容至1L，调节pH值至5.5-7.0，于121℃灭菌得保加利亚乳杆菌培养基；

2)保加利亚乳杆菌培养及菌体收集：

将保加利亚乳杆菌按2％-5％的接种量接入保加利亚乳杆菌培养基中，35-41℃恒温培养18-24h，然后离心收集菌体沉淀，之后用无菌生理盐水洗涤离心得保加利亚乳杆菌菌泥；

3)保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备：

按每g保加利亚乳杆菌菌泥中添加20-30mL的磷酸缓冲液，35-45℃保温1-3h后离心所得上清液即为胞壁蛋白酶的酶液，采用1-3KDa超滤去除小分子物质，然后在保留液中添加CaCl2，控制CaCl2的浓度为8-15mM，冷冻干燥得保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉；

4)羊乳活性饮料的制备：

将鲜羊奶经脱脂后调节pH值至6.0-8.0按质量体积比向其中加入1-3％的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉和0.01-0.04％的CaCl2，于35-45℃下酶解2-4h，然后再按质量体积比添加0.5-1.0％的β-环糊精，0.2-0.4％的拐枣多糖、0.3-0.5％的菊糖、4-6％的赤藓糖醇、3-5％的木糖醇、0.1-0.3％的L-苹果酸，0.10-0.25％的柠檬酸，0.10-0.25％的柠檬酸钠混合均匀后经均质、杀菌后即得到含保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶的羊乳活性饮料。

所述步骤2)的离心是在4-10℃、6000-8000r/min下离心15-25min。

所述步骤3)的磷酸缓冲液的pH＝7.0，每升磷酸缓冲液中含15-30g甘氨酸和2000-4000U变溶菌素。

所述步骤3)的离心是在4-10℃、6000-8000r/min下离心20-30min。

所述步骤4)的均质为温度为15-30℃。

所述步骤4)的拐枣多糖制备过程为：取新鲜拐枣经洗净后进行打浆，然后加入20倍拐枣重量的水，搅拌均匀，于90℃条件下保温2h，然后抽滤获得拐枣多糖提取液，冷却至38℃后按质量体积比接入2％的保拉迪酵母活化液，37℃恒温培养24h除去拐枣中的单糖和双糖，离心收集保拉迪酵母菌体，将上清液用旋转蒸发仪浓缩至1/20，再按1:3的体积比加入无水乙醇，然后用布氏漏斗抽滤获得拐枣粗多糖，再将拐枣粗多糖复水加入氯仿和正丁醇除蛋白，然后取水相再次加入氯仿和正丁醇，三次脱蛋白后通过冷冻干燥获得拐枣多糖。

本发明以羊乳为原料，GRAS微生物——保加利亚乳杆菌的胞壁蛋白酶为生物催化剂，将羊乳中的蛋白质水解成具有ACE抑制活性的寡肽，消费者摄入可以辅助降血压，添加的拐枣多糖既具有稳定剂和降低血糖的作用，可增加羊乳活性饮料的功能性；添加的菊糖为益生元，可促进肠道益生菌的增殖和营养物质的吸收，赤藓糖醇和木糖醇为功能性糖醇，其具有低甜度、低热量、无龋齿性、对血糖影响小等特点，本发明制备的降压肽羊乳活性饮料可作为辅助降血压、降血糖和防龋齿食品，具有多重保健功能。

具体实施方式

以下为结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明。

实施例1：

1)保加利亚乳杆菌培养基制备:

将乳糖15g、酵母粉15g、硫酸锰10mg、吐温80 0.5mL，水苏糖1.5g、蛋白胨4g、磷酸氢二钠4g、谷氨酸5mg、丙氨酸5mg添加到纯净水中，定容至1L，调节pH值至6.0，于121℃灭菌得保加利亚乳杆菌培养基；

2)保加利亚乳杆菌培养及菌体收集：

将保加利亚乳杆菌按2％的接种量接入保加利亚乳杆菌培养基中，37℃恒温培养18h，然后离心收集菌体沉淀，之后用无菌生理盐水洗涤后再离心得保加利亚乳杆菌菌泥；

所述的离心是在4℃、6000r/min下离心15min；

3)保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备：

按每g保加利亚乳杆菌菌泥中添加20mL的pH为7.0的磷酸缓冲液(每升磷酸缓冲液中含15g甘氨酸和2000U变溶菌素)，35℃保温1h后在4℃、6000r/min下离心20min得上清液即为胞壁蛋白酶的酶液，采用1-3KDa超滤去除小分子物质，然后在保留液中添加CaCl2，控制CaCl2的浓度为8mM，冷冻干燥得保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉；

4)羊乳活性饮料的制备：

将鲜羊奶经脱脂后调节pH值至6.0按质量体积比向其中加入1％的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉和0.01％的CaCl2，于37℃下酶解2h，然后再按质量体积比添加0.5％的β-环糊精，0.2％的拐枣多糖、0.3％的菊糖、4％的赤藓糖醇、3％的木糖醇、0.1％的L-苹果酸，0.10％的柠檬酸，0.10％的柠檬酸钠混合均匀后经20℃均质、杀菌后即得到含保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶的羊乳活性饮料，其ACE抑制活性为72％。

实施例2：

1)保加利亚乳杆菌培养基制备:

将乳糖20g、酵母粉20g、硫酸锰15mg、吐温80 0.8mL，水苏糖2g、蛋白胨5g、磷酸氢二钠5g、谷氨酸8mg、丙氨酸7mg添加到纯净水中，定容至1L，调节pH值至6.5，于121℃灭菌得保加利亚乳杆菌培养基；

2)保加利亚乳杆菌培养及菌体收集：

将保加利亚乳杆菌按4％的接种量接入保加利亚乳杆菌培养基中，37℃恒温培养20h，然后离心收集菌体沉淀，之后用无菌生理盐水洗涤后再离心得保加利亚乳杆菌菌泥；

所述的离心是在4℃、7000r/min下离心25min；

3)保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备：

按每g保加利亚乳杆菌菌泥中添加25mL的pH为7.0的磷酸缓冲液(每升磷酸缓冲液中含20g甘氨酸和3000U变溶菌素)，40℃保温2h后在4℃、7000r/min下离心25min得上清液即为胞壁蛋白酶的酶液，采用1-3KDa超滤去除小分子物质，然后在保留液中添加CaCl2，控制CaCl2的浓度为12mM，冷冻干燥得保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉；

4)羊乳活性饮料的制备：

将鲜羊奶经脱脂后调节pH值至7.0按质量体积比向其中加入2％的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉和0.02％的CaCl2，于40℃下酶解2.5h，然后再按质量体积比添加0.8％的β-环糊精，0.3％的拐枣多糖、0.4％的菊糖、5％的赤藓糖醇、4％的木糖醇、0.2％的L-苹果酸，0.15％的柠檬酸，0.15％的柠檬酸钠混合均匀后经20℃均质、杀菌后即得到含保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶的羊乳活性饮料，其ACE抑制活性为80％。

实施例3：

1)保加利亚乳杆菌培养基制备:

将乳糖25g、酵母粉23g、硫酸锰13mg、吐温80 1.0mL，水苏糖2.5g、蛋白胨4.5g、磷酸氢二钠5.5g、谷氨酸10mg、丙氨酸10mg添加到纯净水中，定容至1L，调节pH值至7.0，于121℃灭菌得保加利亚乳杆菌培养基；

2)保加利亚乳杆菌培养及菌体收集：

将保加利亚乳杆菌按3％的接种量接入保加利亚乳杆菌培养基中，41℃恒温培养22h，然后离心收集菌体沉淀，之后用无菌生理盐水洗涤后再离心得保加利亚乳杆菌菌泥；

所述的离心是在8℃、8000r/min下离心18min；

3)保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备：

按每g保加利亚乳杆菌菌泥中添加28mL的pH为7.0的磷酸缓冲液(每升磷酸缓冲液中含30g甘氨酸和4000U变溶菌素)，45℃保温1h后在10℃、6000r/min下离心30min得上清液即为胞壁蛋白酶的酶液，采用1-3KDa超滤去除小分子物质，然后在保留液中添加CaCl2，控制CaCl2的浓度为15mM，冷冻干燥得保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉；

4)羊乳活性饮料的制备：

将鲜羊奶经脱脂后调节pH值至8.0按质量体积比向其中加入3％的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉和0.03％的CaCl2，于35℃下酶解4h，然后再按质量体积比添加1.0％的β-环糊精，0.35％的拐枣多糖、0.5％的菊糖、5％的赤藓糖醇、5％的木糖醇、0.15％的L-苹果酸，0.2％的柠檬酸，0.25％的柠檬酸钠混合均匀后经15℃均质、杀菌后即得到含保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶的羊乳活性饮料，其ACE抑制活性为90％。

实施例4：

1)保加利亚乳杆菌培养基制备:

将乳糖18g、酵母粉25g、硫酸锰20mg、吐温80 0.6mL，水苏糖2.3g、蛋白胨6g、磷酸氢二钠6g、谷氨酸9mg、丙氨酸6mg添加到纯净水中，定容至1L，调节pH值至6.8，于121℃灭菌得保加利亚乳杆菌培养基；

2)保加利亚乳杆菌培养及菌体收集：

将保加利亚乳杆菌按5％的接种量接入保加利亚乳杆菌培养基中，35℃恒温培养24h，然后离心收集菌体沉淀，之后用无菌生理盐水洗涤后再离心得保加利亚乳杆菌菌泥；

所述的离心是在10℃、6000r/min下离心23min；

3)保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶制备：

按每g保加利亚乳杆菌菌泥中添加30mL的pH为7.0的磷酸缓冲液(每升磷酸缓冲液中含25g甘氨酸和3000U变溶菌素)，42℃保温3h后在6℃、8000r/min下离心28min得上清液即为胞壁蛋白酶的酶液，采用1-3KDa超滤去除小分子物质，然后在保留液中添加CaCl2，控制CaCl2的浓度为10mM，冷冻干燥得保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉；

4)羊乳活性饮料的制备：

将鲜羊奶经脱脂后调节pH值至7.0按质量体积比向其中加入2.5％的保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶菌粉和0.04％的CaCl2，于45℃下酶解3h，然后再按质量体积比添加0.9％的β-环糊精，0.4％的拐枣多糖、0.35％的菊糖、6％的赤藓糖醇、4％的木糖醇、0.3％的L-苹果酸，0.25％的柠檬酸，0.20％的柠檬酸钠混合均匀后经30℃均质、杀菌后即得到含保加利亚乳杆菌胞壁蛋白酶的羊乳活性饮料，其ACE抑制活性为85％。

以上实施例的拐枣多糖通过如下方法制备：取新鲜拐枣经洗净后进行打浆，然后加入20倍拐枣重量的水，搅拌均匀，于90℃条件下保温2h，然后抽滤获得拐枣多糖提取液，冷却至38℃后按质量体积比接入2％的保拉迪酵母活化液，37℃恒温培养24h除去拐枣中的单糖和双糖，离心收集保拉迪酵母菌体，将上清液用旋转蒸发仪浓缩至1/20，再按1:3的体积比加入无水乙醇，然后用布氏漏斗抽滤获得拐枣粗多糖，再将拐枣粗多糖复水加入氯仿和正丁醇除蛋白，然后取水相再次加入氯仿和正丁醇，三次脱蛋白后通过冷冻干燥获得拐枣多糖。