技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法及其装置。

背景技术

头孢菌素酰化酶是一类可以催化头孢菌素C(CPC)和戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)生成7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的抗生素工业用酶。但是由于作为游离酶存在对环境敏感、性质不稳定，易在酶促反应中失活及产物难以分离提纯等缺点。因此现有技术中多采用固定化酶技术来解决这一缺陷。

固定化酶技术是产生于20世纪六十年代，目前已广泛应用于生物催化领域的工业生产中。酶的固定化方法可以分为四大类：吸附法、包埋法、共价结合法、交联法。吸附法是最早出现的酶固定化方法，包括物理吸附和离子交换吸附。该法条件温和，酶的构象变化较小或基本不变，因此对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间结合力弱，在不适pH、高盐浓度、高温等条件下，酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后，借助引发剂进行聚合反应，通过物理作用将酶限定在载体的网格中，从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化，反应条件温和，因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失，常存在扩散限制等问题，催化反应受传质阻力的影响，不宜催化大分子底物的反应。共价结合法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法，所得的固定化酶与载体连接牢固，有良好的稳定性及重复使用性，但该法较其它固定方法反应剧烈，固定化酶活性损失更加严重。交联法是利用双功能或多功能交联试剂，在酶分子和交联试剂之间形成共价键，采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料，可以产生物理性质各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段。优点是可用的交联试剂多，技术简易；酶的结合力强，非常稳定。但是仍存在机械性能较差，酶容易在固定化过程中失活等缺点，固定酶成功的关键在于选择一个良好的载体。

发明内容

针对以上存在的技术问题，本发明提供一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法及其装置。

本发明的技术方案为：一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)三维弹性载体的制备：将复合油相溶液和复合水相溶液以体积比为1:1独立装入多功能温控水浴装置中，进行梯度进量搅拌，搅拌转速为400-3000r/min，温度为2-10℃，相较于传统高温，在较低温度下进行乳化反应，可以进一步改善制得的三维弹性载体的机械强度和回弹性，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失；搅拌时间为4-24h，同时，通入氮气进行超声波纳米微曝气，得到微珠乳液，与通入空气相比，通入氮气可防止氧化反应的发生，采用纳米微曝气的方式，将纳米氮气微气泡通入混合液相中，以超声波辅助扩散，在较低温度的乳化过程中，以利用纳米氮气微气泡占位的作用使得微珠颗粒上形成大量的连通孔。有利于得到孔隙率发达且孔径均一的三维弹性载体；将所述微珠乳液利用过滤膜进行过滤，取微珠，将所述微珠利用5倍体积比的去离子水反复冲洗3-5次，得到湿微珠；再将所述湿微珠进行吸水干燥，冷冻存储，即得三维弹性载体；

(2)三维弹性载体的活化：在使用前，先在所述三维弹性载体内加入体积比为1-2倍，温度为30-40℃的去离子水，保温3-10min，进行润湿并解冻；然后再加入为剂量10-30ml/kg的3-二甲氨基丙胺，在30-40℃温度下，以转速为60-80r/min机械搅拌60-90min，过滤，得到活化三维弹性载体；经过活化后的三维弹性载体可增加对酶的粘附力。

(3)酶的固定化：将所述活化三维弹性载体、葡聚糖二乙醛及浓度为250g/L的头孢菌素酰化酶溶液以质量比为60-80:3-4:20装入所述多功能温控水浴装置中，调节pH至7.5-8.0，反应温度为45-50℃，超声搅拌12-14h，得到交联修饰酶；经交联修饰后的头孢菌素酰化酶比未修饰前的半衰期延长4-6倍；

(4)交联修饰酶的后处理：以pH为7.5-8.0的EMSA缓冲液冲洗所述交联修饰酶三次，每次1min，经滤膜过滤后，得到无杂交联修饰酶；将所述无杂交联修饰酶与浓度为50-250mg/L的茶多酚按照质量比为1:2-3的比例混合后，转移至多功能温控水浴装置中，以2-4℃/h的升温速度逐步从室温升温至55℃，并以30-60r/min的转速辅助超声搅拌，抽滤，收集固体，即得头孢菌素酰化酶固定酶；茶多酚作为一种天然抗氧化剂，能够保护交联修饰酶在梯度升温热处理过程中不被氧自由基所干扰和破坏，保持头孢菌素酰化酶固定酶的活性，并且经梯度升温热处理后，还可大大提高头孢菌素酰化酶固定酶的热稳定性。

进一步地，所述复合油相溶液按照重量百分比包括：7-10％四氯化碳、14-16％异丙醇、15-17％硅酮油、9-11％乙醚、1-2％大豆异黄酮、15-17％松节油、1-3％氟碳表面活性剂，余量为木蜡油。大豆异黄酮作为抗氧化剂，能够防止油相成分的自氧化，氟碳表面活性剂可以显著提高复合油相溶液在复合水相溶液中的分散性，从而提高制备的三维弹性载体的均一性。

进一步地，所述复合水相溶液按照重量百分比包括：8-10％聚氨基酸、9-13％聚乙二醇－聚羧酸聚合物、14-16％聚乙烯吡咯烷酮、10-13％聚乳酸、3-5％明胶、6-9％胶质蛋白、1-3％瓜尔胶、1-3％红藻胶、0.5-1％格尼泊素，余量为纯水。格尼泊素作为固化剂可提高乳液体系的稳定性。

进一步地，所述梯度进量方法为：所述复合油相溶液和复合水相溶液按照1:1的质量比，在第0min、10min、20min、30min时，分别进给复合油相溶液和复合水相溶液总质量的25％。分批次进量，可保证复合油相溶液和复合水相溶液乳化效率

进一步地，所述氮气的曝气量为0.1-0.5L/min，曝气量过小，则不能够保证微珠中的微气泡数量均匀，曝气量过大，则由微气泡占位造成的连通孔过多，反而会降低微珠的孔隙率。

进一步地，所述多功能温控水浴装置包括水浴槽、内胆槽、底座、超声波发生器、加热器、总控器、L形支撑臂、搅拌杆、电机、曝气管、气体连接器，所述水浴槽固定连接在所述底座的上表面，所述内胆槽的顶口设有外沿层，所述外沿层卡接在水浴槽顶部，使内胆槽悬空在水浴槽的内部中心位置，所述总控器设置在底座的内部中心位置，所述超声波发生器电性连接在总控器的上方，超声波发生器的发射端与水浴槽底部相连，所述加热器均匀分布在水浴槽底部，并与总控器电性连接，所述L形支撑臂的竖段固定连接在底座的后部，L形支撑臂的横段位于内胆槽的正上方，所述电机固定在L形支撑臂的横段上方，所述气体连接器固定连接在L形支撑臂的横段下方，气体连接器与外部气源相连，所述曝气管连接在气体连接器的下方，所述搅拌杆的上端贯穿曝气管与电机的输出轴相连，搅拌杆的下端设有搅拌叶轮。

更进一步地，所述水浴槽包括储液盒一、储液盒二、冷凝剂盒，所述储液盒一设置在水浴槽外壁左侧，储液盒二设置在水浴槽外壁右侧，所述冷凝剂盒设置在水浴槽外壁前侧，储液盒一、储液盒二的顶部分别通过旋转进液管一延伸至所述内胆槽的内侧壁处，冷凝剂盒通过旋转进液管二延伸至水浴槽的内侧壁处，所述旋转进液管一、旋转进液管二上分别设有微型计量泵，所述微型计量泵与所述总控器电性连接。

更进一步地，所述L形支撑臂的竖段为可伸缩结构，方便将连接在下方的搅拌和曝气装置提出内胆槽，进而单独分离出内胆槽及内部物体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明在2-10℃的较低温度下经复合油相溶液和复合水相溶液混合制得三维弹性载体，相较于传统高温，在较低温度下进行乳化反应，可以进一步改善制得的三维弹性载体的机械强度和回弹性，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失。

(2)本发明在乳化反应发生的同时，采用纳米微曝气的方式，将纳米氮气微气泡通入混合液相中，以超声波辅助扩散，在较低温度的乳化过程中，以利用纳米氮气微气泡占位的作用使得微珠颗粒上形成大量的连通孔，有利于得到孔隙率发达且孔径均一的三维弹性载体；能够为交联修饰酶提供巨大的空间。

(3)经本发明的方法修饰后的头孢菌素酰化酶比未修饰前的半衰期延长4-6倍。

总之，由本发明制备的头孢菌素酰化酶固定酶具有酶结合力强且稳定性好、机械性能强、酶活性高、半衰期长等优点。

附图说明

图1是本发明的多功能温控水浴装置的主剖视图；

图2是本发明的多功能温控水浴装置的右视图。

其中，1-水浴槽、2-内胆槽、3-底座、4-超声波发生器、5-加热器、6-总控器、7-L形支撑臂、8-搅拌杆、9-电机、10-曝气管、11-气体连接器、12-外沿层、13-搅拌叶轮、14-储液盒一、15-储液盒二、16-冷凝剂盒、17-旋转进液管一、18-旋转进液管二、19-微型计量泵。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明，下面通过附图1-2对本发明做进一步地说明。

实施例1

一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)三维弹性载体的制备：将复合油相溶液和复合水相溶液以体积比为1:1独立装入多功能温控水浴装置中，其中，所述复合油相溶液按照重量百分比包括：7％四氯化碳、14％异丙醇、15％硅酮油、9％乙醚、1％大豆异黄酮、15％松节油、1％氟碳表面活性剂，余量为木蜡油。大豆异黄酮作为抗氧化剂，能够防止油相成分的自氧化，氟碳表面活性剂可以显著提高复合油相溶液在复合水相溶液中的分散性，从而提高制备的三维弹性载体的均一性。所述复合水相溶液按照重量百分比包括：8％聚氨基酸、9％聚乙二醇－聚羧酸聚合物、14％聚乙烯吡咯烷酮、10％聚乳酸、3％明胶、6％胶质蛋白、1％瓜尔胶、1％红藻胶、0.5％格尼泊素，余量为纯水。格尼泊素作为固化剂可提高乳液体系的稳定性。进行梯度进量搅拌，所述梯度进量方法为：所述复合油相溶液和复合水相溶液按照1:1的质量比，在第0min、10min、20min、30min时，分别进给复合油相溶液和复合水相溶液总质量的25％。分批次进量，可保证复合油相溶液和复合水相溶液乳化效率。搅拌转速为400r/min，温度为2℃，相较于传统高温，在较低温度下进行乳化反应，可以进一步改善制得的三维弹性载体的机械强度和回弹性，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失；搅拌时间为4h，同时，通入氮气进行超声波纳米微曝气，得到微珠乳液，所述氮气的曝气量为0.1L/min，曝气量过小，则不能够保证微珠中的微气泡数量均匀，曝气量过大，则由微气泡占位造成的连通孔过多，反而会降低微珠的孔隙率。与通入空气相比，通入氮气可防止氧化反应的发生，采用纳米微曝气的方式，将纳米氮气微气泡通入混合液相中，以超声波辅助扩散，在较低温度的乳化过程中，以利用纳米氮气微气泡占位的作用使得微珠颗粒上形成大量的连通孔。有利于得到孔隙率发达且孔径均一的三维弹性载体；将所述微珠乳液利用过滤膜进行过滤，取微珠，将所述微珠利用5倍体积比的去离子水反复冲洗3次，得到湿微珠；再将所述湿微珠进行吸水干燥，冷冻存储，即得三维弹性载体；

(2)三维弹性载体的活化：在使用前，先在所述三维弹性载体内加入体积比为1倍，温度为30℃的去离子水，保温3min，进行润湿并解冻；然后再加入为剂量10ml/kg的3-二甲氨基丙胺，在30℃温度下，以转速为60r/min机械搅拌60min，过滤，得到活化三维弹性载体；经过活化后的三维弹性载体可增加对酶的粘附力。

(3)酶的固定化：将所述活化三维弹性载体、葡聚糖二乙醛及浓度为250g/L的头孢菌素酰化酶溶液以质量比为60:3:20装入所述多功能温控水浴装置中，调节pH至7.5，反应温度为45℃，超声搅拌12h，得到交联修饰酶；经交联修饰后的头孢菌素酰化酶比未修饰前的半衰期延长4倍；

(4)交联修饰酶的后处理：以pH为7.5的EMSA缓冲液冲洗所述交联修饰酶三次，每次1min，经滤膜过滤后，得到无杂交联修饰酶；将所述无杂交联修饰酶与浓度为50mg/L的茶多酚按照质量比为1:2的比例混合后，转移至多功能温控水浴装置中，以2℃/h的升温速度逐步从室温升温至55℃，并以30r/min的转速辅助超声搅拌，抽滤，收集固体，即得头孢菌素酰化酶固定酶；茶多酚作为一种天然抗氧化剂，能够保护交联修饰酶在梯度升温热处理过程中不被氧自由基所干扰和破坏，保持头孢菌素酰化酶固定酶的活性，并且经梯度升温热处理后，还可大大提高头孢菌素酰化酶固定酶的热稳定性。

如图1-2所示，多功能温控水浴装置包括水浴槽1、内胆槽2、底座3、超声波发生器4、加热器5、总控器6、L形支撑臂7、搅拌杆8、电机9、曝气管10、气体连接器11，水浴槽1固定连接在底座3的上表面，水浴槽1包括储液盒一14、储液盒二15、冷凝剂盒16，储液盒一14设置在水浴槽1外壁左侧，储液盒二15设置在水浴槽1外壁右侧，冷凝剂盒16设置在水浴槽1外壁前侧，储液盒一14、储液盒二15的顶部分别通过旋转进液管一17延伸至内胆槽2的内侧壁处，冷凝剂盒16通过旋转进液管二18延伸至水浴槽1的内侧壁处，旋转进液管一17、旋转进液管二18上分别设有微型计量泵19，微型计量泵19与总控器6电性连接。内胆槽2的顶口设有外沿层12，外沿层12卡接在水浴槽1顶部，使内胆槽2悬空在水浴槽1的内部中心位置，总控器6设置在底座3的内部中心位置，超声波发生器4电性连接在总控器6的上方，超声波发生器4的发射端与水浴槽1底部相连，加热器5均匀分布在水浴槽1底部，并与总控器6电性连接，L形支撑臂7的竖段固定连接在底座3的后部，L形支撑臂7的竖段为可伸缩结构，方便将连接在下方的搅拌和曝气装置提出内胆槽2，进而单独分离出内胆槽2及内部物体。L形支撑臂7的横段位于内胆槽2的正上方，电机9固定在L形支撑臂7的横段上方，气体连接器11固定连接在L形支撑臂7的横段下方，气体连接器11与外部气源相连，曝气管10连接在气体连接器11的下方，搅拌杆8的上端贯穿曝气管10与电机9的输出轴相连，搅拌杆8的下端设有搅拌叶轮13。

结果分析：将处理后的头孢菌素酰化酶固定酶进行酶活测定，酶活为98U/g，在pH＝9.0,温度为45℃的条件下，测得半衰期时间为80min。

实施例2

一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)三维弹性载体的制备：将复合油相溶液和复合水相溶液以体积比为1:1独立装入多功能温控水浴装置中，其中，所述复合油相溶液按照重量百分比包括：8.5％四氯化碳、15％异丙醇、16％硅酮油、10％乙醚、1.5％大豆异黄酮、16％松节油、2％氟碳表面活性剂，余量为木蜡油。大豆异黄酮作为抗氧化剂，能够防止油相成分的自氧化，氟碳表面活性剂可以显著提高复合油相溶液在复合水相溶液中的分散性，从而提高制备的三维弹性载体的均一性。所述复合水相溶液按照重量百分比包括：9％聚氨基酸、10.5％聚乙二醇－聚羧酸聚合物、15％聚乙烯吡咯烷酮、11.5％聚乳酸、4％明胶、7.5％胶质蛋白、2％瓜尔胶、2％红藻胶、0.75％格尼泊素，余量为纯水。格尼泊素作为固化剂可提高乳液体系的稳定性。进行梯度进量搅拌，所述梯度进量方法为：所述复合油相溶液和复合水相溶液按照1:1的质量比，在第0min、10min、20min、30min时，分别进给复合油相溶液和复合水相溶液总质量的25％。分批次进量，可保证复合油相溶液和复合水相溶液乳化效率。搅拌转速为1700r/min，温度为4℃，相较于传统高温，在较低温度下进行乳化反应，可以进一步改善制得的三维弹性载体的机械强度和回弹性，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失；搅拌时间为14h，同时，通入氮气进行超声波纳米微曝气，得到微珠乳液，所述氮气的曝气量为0.3L/min，曝气量过小，则不能够保证微珠中的微气泡数量均匀，曝气量过大，则由微气泡占位造成的连通孔过多，反而会降低微珠的孔隙率。与通入空气相比，通入氮气可防止氧化反应的发生，采用纳米微曝气的方式，将纳米氮气微气泡通入混合液相中，以超声波辅助扩散，在较低温度的乳化过程中，以利用纳米氮气微气泡占位的作用使得微珠颗粒上形成大量的连通孔。有利于得到孔隙率发达且孔径均一的三维弹性载体；将所述微珠乳液利用过滤膜进行过滤，取微珠，将所述微珠利用5倍体积比的去离子水反复冲洗4次，得到湿微珠；再将所述湿微珠进行吸水干燥，冷冻存储，即得三维弹性载体；

(2)三维弹性载体的活化：在使用前，先在所述三维弹性载体内加入体积比为2倍，温度为35℃的去离子水，保温6min，进行润湿并解冻；然后再加入为剂量20ml/kg的3-二甲氨基丙胺，在35℃温度下，以转速为70r/min机械搅拌75min，过滤，得到活化三维弹性载体；经过活化后的三维弹性载体可增加对酶的粘附力。

(3)酶的固定化：将所述活化三维弹性载体、葡聚糖二乙醛及浓度为250g/L的头孢菌素酰化酶溶液以质量比为70:3:20装入所述多功能温控水浴装置中，调节pH至7.9，反应温度为47℃，超声搅拌13h，得到交联修饰酶；经交联修饰后的头孢菌素酰化酶比未修饰前的半衰期延长6倍；

(4)交联修饰酶的后处理：以pH为7.9的EMSA缓冲液冲洗所述交联修饰酶三次，每次1min，经滤膜过滤后，得到无杂交联修饰酶；将所述无杂交联修饰酶与浓度为150mg/L的茶多酚按照质量比为1:2.5的比例混合后，转移至多功能温控水浴装置中，以3℃/h的升温速度逐步从室温升温至55℃，并以45r/min的转速辅助超声搅拌，抽滤，收集固体，即得头孢菌素酰化酶固定酶；茶多酚作为一种天然抗氧化剂，能够保护交联修饰酶在梯度升温热处理过程中不被氧自由基所干扰和破坏，保持头孢菌素酰化酶固定酶的活性，并且经梯度升温热处理后，还可大大提高头孢菌素酰化酶固定酶的热稳定性。

如图1-2所示，多功能温控水浴装置包括水浴槽1、内胆槽2、底座3、超声波发生器4、加热器5、总控器6、L形支撑臂7、搅拌杆8、电机9、曝气管10、气体连接器11，水浴槽1固定连接在底座3的上表面，水浴槽1包括储液盒一14、储液盒二15、冷凝剂盒16，储液盒一14设置在水浴槽1外壁左侧，储液盒二15设置在水浴槽1外壁右侧，冷凝剂盒16设置在水浴槽1外壁前侧，储液盒一14、储液盒二15的顶部分别通过旋转进液管一17延伸至内胆槽2的内侧壁处，冷凝剂盒16通过旋转进液管二18延伸至水浴槽1的内侧壁处，旋转进液管一17、旋转进液管二18上分别设有微型计量泵19，微型计量泵19与总控器6电性连接。内胆槽2的顶口设有外沿层12，外沿层12卡接在水浴槽1顶部，使内胆槽2悬空在水浴槽1的内部中心位置，总控器6设置在底座3的内部中心位置，超声波发生器4电性连接在总控器6的上方，超声波发生器4的发射端与水浴槽1底部相连，加热器5均匀分布在水浴槽1底部，并与总控器6电性连接，L形支撑臂7的竖段固定连接在底座3的后部，L形支撑臂7的竖段为可伸缩结构，方便将连接在下方的搅拌和曝气装置提出内胆槽2，进而单独分离出内胆槽2及内部物体。L形支撑臂7的横段位于内胆槽2的正上方，电机9固定在L形支撑臂7的横段上方，气体连接器11固定连接在L形支撑臂7的横段下方，气体连接器11与外部气源相连，曝气管10连接在气体连接器11的下方，搅拌杆8的上端贯穿曝气管10与电机9的输出轴相连，搅拌杆8的下端设有搅拌叶轮13。

结果分析：将处理后的头孢菌素酰化酶固定酶进行酶活测定，酶活为121U/g，在pH＝9.0,温度为45℃的条件下，测得半衰期时间为120min。

实施例3

一种头孢菌素酰化酶固定酶的制备方法，包括以下步骤：

(1)三维弹性载体的制备：将复合油相溶液和复合水相溶液以体积比为1:1独立装入多功能温控水浴装置中，其中，所述复合油相溶液按照重量百分比包括：10％四氯化碳、16％异丙醇、17％硅酮油、11％乙醚、2％大豆异黄酮、17％松节油、3％氟碳表面活性剂，余量为木蜡油。大豆异黄酮作为抗氧化剂，能够防止油相成分的自氧化，氟碳表面活性剂可以显著提高复合油相溶液在复合水相溶液中的分散性，从而提高制备的三维弹性载体的均一性。所述复合水相溶液按照重量百分比包括：10％聚氨基酸、13％聚乙二醇－聚羧酸聚合物、16％聚乙烯吡咯烷酮、13％聚乳酸、5％明胶、9％胶质蛋白、3％瓜尔胶、3％红藻胶、1％格尼泊素，余量为纯水。格尼泊素作为固化剂可提高乳液体系的稳定性。进行梯度进量搅拌，所述梯度进量方法为：所述复合油相溶液和复合水相溶液按照1:1的质量比，在第0min、10min、20min、30min时，分别进给复合油相溶液和复合水相溶液总质量的25％。分批次进量，可保证复合油相溶液和复合水相溶液乳化效率。搅拌转速为3000r/min，温度为10℃，相较于传统高温，在较低温度下进行乳化反应，可以进一步改善制得的三维弹性载体的机械强度和回弹性，使减少并缓解固定化过程中酶分子所受到的碰撞力，维持酶蛋白的正常构象，从而减少酶活的损失；搅拌时间为24h，同时，通入氮气进行超声波纳米微曝气，得到微珠乳液，所述氮气的曝气量为0.5L/min，曝气量过小，则不能够保证微珠中的微气泡数量均匀，曝气量过大，则由微气泡占位造成的连通孔过多，反而会降低微珠的孔隙率。与通入空气相比，通入氮气可防止氧化反应的发生，采用纳米微曝气的方式，将纳米氮气微气泡通入混合液相中，以超声波辅助扩散，在较低温度的乳化过程中，以利用纳米氮气微气泡占位的作用使得微珠颗粒上形成大量的连通孔。有利于得到孔隙率发达且孔径均一的三维弹性载体；将所述微珠乳液利用过滤膜进行过滤，取微珠，将所述微珠利用5倍体积比的去离子水反复冲洗5次，得到湿微珠；再将所述湿微珠进行吸水干燥，冷冻存储，即得三维弹性载体；

(2)三维弹性载体的活化：在使用前，先在所述三维弹性载体内加入体积比为2倍，温度为40℃的去离子水，保温10min，进行润湿并解冻；然后再加入为剂量30ml/kg的3-二甲氨基丙胺，在40℃温度下，以转速为80r/min机械搅拌90min，过滤，得到活化三维弹性载体；经过活化后的三维弹性载体可增加对酶的粘附力。

(3)酶的固定化：将所述活化三维弹性载体、葡聚糖二乙醛及浓度为250g/L的头孢菌素酰化酶溶液以质量比为80:4:20装入所述多功能温控水浴装置中，调节pH至8.0，反应温度为50℃，超声搅拌14h，得到交联修饰酶；经交联修饰后的头孢菌素酰化酶比未修饰前的半衰期延长5倍；

(4)交联修饰酶的后处理：以pH为8.0的EMSA缓冲液冲洗所述交联修饰酶三次，每次1min，经滤膜过滤后，得到无杂交联修饰酶；将所述无杂交联修饰酶与浓度为250mg/L的茶多酚按照质量比为1:3的比例混合后，转移至多功能温控水浴装置中，以4℃/h的升温速度逐步从室温升温至55℃，并以60r/min的转速辅助超声搅拌，抽滤，收集固体，即得头孢菌素酰化酶固定酶；茶多酚作为一种天然抗氧化剂，能够保护交联修饰酶在梯度升温热处理过程中不被氧自由基所干扰和破坏，保持头孢菌素酰化酶固定酶的活性，并且经梯度升温热处理后，还可大大提高头孢菌素酰化酶固定酶的热稳定性。

如图1-2所示，多功能温控水浴装置包括水浴槽1、内胆槽2、底座3、超声波发生器4、加热器5、总控器6、L形支撑臂7、搅拌杆8、电机9、曝气管10、气体连接器11，水浴槽1固定连接在底座3的上表面，水浴槽1包括储液盒一14、储液盒二15、冷凝剂盒16，储液盒一14设置在水浴槽1外壁左侧，储液盒二15设置在水浴槽1外壁右侧，冷凝剂盒16设置在水浴槽1外壁前侧，储液盒一14、储液盒二15的顶部分别通过旋转进液管一17延伸至内胆槽2的内侧壁处，冷凝剂盒16通过旋转进液管二18延伸至水浴槽1的内侧壁处，旋转进液管一17、旋转进液管二18上分别设有微型计量泵19，微型计量泵19与总控器6电性连接。内胆槽2的顶口设有外沿层12，外沿层12卡接在水浴槽1顶部，使内胆槽2悬空在水浴槽1的内部中心位置，总控器6设置在底座3的内部中心位置，超声波发生器4电性连接在总控器6的上方，超声波发生器4的发射端与水浴槽1底部相连，加热器5均匀分布在水浴槽1底部，并与总控器6电性连接，L形支撑臂7的竖段固定连接在底座3的后部，L形支撑臂7的竖段为可伸缩结构，方便将连接在下方的搅拌和曝气装置提出内胆槽2，进而单独分离出内胆槽2及内部物体。L形支撑臂7的横段位于内胆槽2的正上方，电机9固定在L形支撑臂7的横段上方，气体连接器11固定连接在L形支撑臂7的横段下方，气体连接器11与外部气源相连，曝气管10连接在气体连接器11的下方，搅拌杆8的上端贯穿曝气管10与电机9的输出轴相连，搅拌杆8的下端设有搅拌叶轮13。

结果分析：将处理后的头孢菌素酰化酶固定酶进行酶活测定，酶活为105U/g，在pH＝9.0,温度为45℃的条件下，测得半衰期时间为100min。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。