技术领域

本发明属于医药和食品安全技术领域，涉及白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物在抑制、清除白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜中的应用。

背景技术

白色念珠菌(Candida albicans)又称白色假丝酵母菌，是口腔常见菌群，也是口腔中重要的条件致病性真菌，在一定条件下，可引起多种口腔黏膜疾病。白色念珠菌是临床上引起深部真菌感染最常见的病原菌之一。变形链球菌(Streptococcus mutans)是一种导致龋齿的细菌病原体，可以继发牙髓炎和根尖周炎，甚至能引起牙槽骨和颌骨炎症。真菌、细菌混合感染会造成机体局部脓肿、蜂窝织炎，严重的可致败血症甚至死亡。

近年来随着医疗技术的进步，医疗植入体如导管、人工瓣膜和关节置换物等用于临床治疗的几率增加，病原菌粘附在医疗植入体表面形成生物被膜，造成生物被膜相关的感染的发病率上升。生物被膜的形成使其内部的真菌、细菌产生极强的抵抗机体免疫系统作用的能力，耐药性明显增强，治疗难度增大。白色念珠菌、变形链球菌是导致相关生物被膜感染的常见分离菌，且有时呈混合感染。目前，虽有研究发现部分抗菌药物，如环丙沙星和阿奇霉素等可以在一定程度上干扰细菌与真菌生物被膜的形成，但其作用方式单一，长期使用也易引起细菌与真菌的耐药。有研究表明，多种中药成分抑菌效果明显且能够抑制细菌与真菌生物被膜的形成，揭示了其在应对耐药菌上的优势。同时中草药具有毒副作用小、药源广泛、价格便宜的优点，在面对真菌、细菌耐药性增强的问题上，中草药成为寻找高效低毒的抑制剂的安全、有效的来源。

白屈菜红碱是传统天然药用植物白屈菜的主要有效成分之一，除具有解热、镇痛作用外，还具有抗菌药理作用。其分子式为C21H18NO4，分子量为348.37。血根碱是传统天然药用植物白屈菜的主要有效成分之一，除具有抗炎、抗肿瘤作用外，还具有抗菌药理作用。其分子式为C20H14NO4，分子量为332.33。小檗碱是传统天然药用植物黄连的主要有效成分之一，亦称黄连素，除具有清热燥湿、泻火解毒作用外，还具有抗菌药理作用。其分子式为C20H18NO4，分子量为336.37，分子结构如下：

白屈菜有止咳、利尿、解毒等功效，还可治疗痢疾，黄疸等疾病，白屈菜的提取物中含有多种生物碱，其中白屈菜红碱和血根碱是白屈菜的主要抗菌成分，丁浩等报道了中药活性成分(例如，血根碱、白屈菜红碱)对罗非鱼源无乳链球菌体外抑菌及生物被膜消除效果，刘冰等报道了盐酸小檗碱对猪链球菌生物被膜的体外干预作用。解光艳等报道了小檗碱具有抑制白色念珠菌混合菌生物被膜形成的作用，许颖等报道了盐酸小檗碱对变形链球菌生物膜及其致龋毒力因子的作用。尽管有报道指出白屈菜红碱或小檗碱可以通过与唑类药物一起使用，发挥协同抗耐药真菌作用，但是这些药物往往对机体造成一定损伤。目前针对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜仍缺乏有效的中药抗菌剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌中药成分组合物在杀灭生物被膜中的应用，本发明利用三种中药成分白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物可以抑制、清除白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种抗菌中药成分组合物在抑制及清除白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜中的应用，所述中药成分组合物包括白屈菜红碱、血根碱和小檗碱。

优选的，所述中药成分组合物中，白屈菜红碱:血根碱:小檗碱的质量比为1:1:(1～2)。

优选的，所述中药成分组合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的最小抑菌浓度和最低清除浓度分别为4μg/mL和32μg/mL。

优选的，所述中药成分组合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜具有体外杀灭作用。

优选的，所述杀灭作用是指抑制白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的形成、清除成熟的白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜。

上述抗菌中药成分组合物在制备用于杀灭白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的药物中的应用。

优选的，所述药物包括白屈菜红碱、血根碱与小檗碱的混合物以及药学上可接受的制剂(例如，搽剂等外用制剂)的辅料或载体。

本发明的有益的效果体现在：

本发明通过发掘中药活性成分的协同作用，发现了白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜具有显著的体外干预作用，能有效的抑制白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的形成，以及清除成熟的白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜，为白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜抑制剂的研究开发和应用提供新的思路和来源，在医药等领域具有广泛的应用价值。

附图说明

图1为三种中药成分白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物作为药物在不同药物浓度下对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的抑制作用。

图2为三种中药成分白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物作为药物在不同药物浓度下对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜结构的抑制结果的电镜照片。

图3为三种中药成分白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物作为药物在不同药物浓度下对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜结构的清除结果电镜照片。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明。所述实施例仅用于解释本发明的内容，并非对本发明保护范围的限制。

(一)材料、试剂和仪器

1.1实验菌株

白色念珠菌SC5314购自美国标准菌种收藏中心；变形链球菌ATCC25175购自美国标准菌种收藏中心。

1.2试剂来源

二甲基亚砜(DMSO)、生理盐水、甲醇、酵母浸粉、葡萄糖、蛋白胨、戊二醛、无水乙醇、乙酸戊乙酯均购于上海西格玛奥德里奇贸易有限公司。

1.3主要试剂的配制

YPD液体培养基：称取5g酵母浸粉、10g葡萄糖和10g蛋白胨，加入500mL蒸馏水，高压蒸汽灭菌。

1％DMSO溶液：量取99mL水，加入1mL 100％的DMSO，混匀。

99％甲醇溶液：量取1mL水，加入99mL 100％的甲醇，混匀。

0.1％结晶紫溶液：称取结晶紫0.1g，加入100mL蒸馏水，混匀。

33％冰醋酸溶液：量取33mL的冰醋酸，加入67mL蒸馏水，混匀。

1.4实验仪器

高压灭菌器(天津泰斯特仪器有限公司)；DH6000A电热恒温培养箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；超净工作台(苏州苏洁净化设备有限公司)；96孔板、24孔板(丹麦赛默飞世尔科技有限公司)；电子天平(上海金科天美有限公司)；酶标仪(深圳迈瑞生物医疗有限公司)；场发射扫描电镜(美国FEI有限公司)

(二)白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的干预作用

1、实验方法

1.1药物的配制

精密称取白屈菜红碱0.01g、血根碱0.01g及小檗碱0.01g，分别溶于10mL 1％的DMSO中，得到三种不同的中药成分溶液，然后按照两组分混合及三组分混合的需要(白屈菜红碱+血根碱、白屈菜红碱+小檗碱、血根碱+小檗碱、白屈菜红碱+血根碱+小檗碱)，取等体积的相应的中药成分溶液配成浓度为1mg/mL的药物储备液。取1mL药物储备液，过0.22μm的有机相滤膜，再用1％的DMSO溶液倍比稀释，得到供测量MIC使用的不同浓度的药物。

1.2菌液的配制

取在-20℃下保存的白色念珠菌SC5314、变形链球菌ATCC25175，无菌操作下用接种环分别接种于含有YPD液体培养基的不同玻璃试管中，放入37℃恒温培养箱中培养24h。以相同接种方法对白色念珠菌、变形链球菌分别进行传代纯化(传代纯化保证菌株的单一性，一般一代即可)培养后，稀释至1.0×106CFU/mL，备用。

1.3白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物对白色念珠菌与变形链球菌最小抑菌浓度的测定

稀释法是通过测定等量的菌液在含不同浓度药物的液体培养基中的生长有无，以及生长后的培养基的浊度来确定药物的抗菌效力，由稀释法所测得的药物抑制检测菌生长的最低浓度称为“最小抑菌浓度”。该法可以准确定量的测定药物的抗菌活性，方法简便、快捷，本发明具体采用96孔板微量稀释法来测定抑菌活性。

将稀释好的菌液用移液器加入96孔板中，每个孔加180μL单一或混合菌液(等体积比混合)，然后分别吸取20μL稀释至不同浓度的不同组分混合药物(白屈菜红碱+血根碱、白屈菜红碱+小檗碱、血根碱+小檗碱、白屈菜红碱+血根碱+小檗碱)，加到96孔板中。使得终体系为200μL。再分别做一个不加药物只含培养基的对照组和只加菌液不加药物的对照组。每个浓度的药物做3组平行，于37℃恒温培养箱中培养24h后观察结果，以无菌体生长的孔中药物的最低浓度作为药物对白色念珠菌与变形链球菌的最小抑菌浓度(MIC)。

1.4不同药物浓度下白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物干预生物被膜形成及清除生物被膜能力的检测

1.4.1生物被膜的建立

按1.2菌液的配制步骤配制菌液，按1.1药物的配制步骤配制药物。向96孔板中加入混合菌液和各个浓度药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)，每孔共200μL(药物浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC)。另设空白对照孔(只含有培养基)、DMSO对照孔(加入与药物等量体积的DMSO)和阴性对照孔(不加药物的生物被膜生长对照)。每个浓度的药物做3组平行，于37℃恒温培养箱中培养24h，建立了体外白色念珠菌和变形链球菌双物种生物被膜模型。

1.4.2结晶紫染色

结晶紫染色的方法可以快速、简便的测量药物(例如，白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)对生物被膜的干预作用。通过不同药物浓度下OD值的大小，可以反映药物干预生物被膜的能力强弱。

培养好后取出96孔板，弃去管内全部液体(生物被膜粘附在管底部)，并用无菌PBS轻轻冲洗3次(冲洗浮菌，减少误差干扰)。再用99％的甲醇溶液固定30min晾干，然后用0.1％的结晶紫200μL染色30min，并冲洗晾干。加入33％的冰醋酸溶液，振荡器上作用30min。用酶标仪在570nm处，测定吸光度。

1.4.3扫描电镜观察

1.4.3.1生物被膜的建立

按1.2菌液的配制步骤配制菌液，按1.1药物的配制步骤配制药物。分别设置抑制组和清除组。

抑制组中取1.8mL稀释后的混合菌液加入到24孔板中，再加入200μL药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)，最后使药物的终浓度达到1/4MIC、1/2MIC、MIC。另设置一个对照孔(不加药物)。把细胞爬片用酒精消毒后，放入24孔板中，于37℃恒温培养箱中培养24h。

清除组中取2mL稀释后的混合菌液加入到24孔板中，把细胞爬片用酒精消毒后，放入24孔板中，于37℃恒温培养箱中培养24h，生物被膜生长完毕，加入不同浓度梯度的药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)使药物终浓度为0MIC、8MIC、16MIC和32MIC。随后于37℃恒温培养箱中培养5h。

1.4.3.2生物被膜抑制和清除结果观察

场发射扫描电子显微镜在观察生物被膜时，可在不破坏生物被膜完整性的情况下，直观观察生物被膜形态，确定生物被膜的厚度，并且清晰观察生物被膜的分布与被其包裹的细菌的形态。

将细胞爬片取出，用无菌PBS轻轻漂洗，除去生物被膜表面的游离细菌。加入电镜用戊二醛，-4℃避光固定细胞生物被膜2h，再用不同梯度的乙醇(30％、50％、70％、90％、100％)进行脱水处理。最后使用乙酸戊乙酯进行避光固定5h，置场发射扫描电镜观察。每个标本取3个随机视野，观察不同浓度的药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的影响。

1.5统计学数据分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理与分析，数据以±SD表示，采用多重比较和单因素方差分析对各组数据进行分析和比较。P<0.05为差异性显著，P<0.01为差异性极显著。

2、实验结果

2.1白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌SC5314与变形链球菌ATCC25175的MIC测定结果

根据以上实验方法1.3，通过参照浊度可以得出，白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌SC5314的MIC为2μg/mL，对变形链球菌ATCC25175的MIC为2μg/mL，对白色念珠菌SC5314与变形链球菌ATCC25175混合菌液的MIC为4μg/mL。具体试验结果见表1。

表1.不同组分的混合药物对白色念珠菌与变形链球菌的抑制结果(MIC)

2.2不同药物浓度下对生物被膜形成能力的干预作用

如图1所示，在建立了体外生物被膜模型的基础上，使用酶标仪在吸光度为570nm处测定各个药物浓度组的OD值。OD值随着药物浓度的增大而减小，呈现负相关。经过SPSS软件分析，每个药物浓度组的OD值与阴性对照组存在显著性差异，P<0.05。DMSO对照组和阴性对照组的OD值之间，没有显著性差异，P>0.05。根据结晶紫染色法得到的结果，白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜有确切的干预作用。

2.3不同药物浓度下药物对生物被膜内细菌活性的影响

通过场发射扫描电子显微镜观察，不同浓度药物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的影响具体如下：

如图2所示，通过场发射扫描电子显微镜观察，在抑制组中，没有加药物的情况下生物被膜形成较厚。而当药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)浓度达到1/4MIC时，生物被膜明显变薄，菌体活力呈下降趋势。当药物浓度达到1/2MIC时，生物被膜被明显抑制，菌体密度呈下降趋势。

如图3所示，通过场发射扫描电子显微镜观察，在清除组中，药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)浓度达到8MIC时，生物被膜开始被有效清除。而当药物浓度达到16MIC时，生物被膜与菌体生物量明显变小变薄，呈现出单层状态。当药物浓度达到32MIC时，生物被膜被显著清除，菌体密度稀疏。

根据以上观察结果，说明在药物(白屈菜红碱、血根碱和小檗碱的混合物)的作用下，生物被膜内的活菌受到抑制，药物可以作用到生物被膜内部，即药物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜有很好的抑制作用并且对成熟的白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜有显著的清除作用。

综上所述，本发明采用生物被膜体外模型，首次提出了白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的体外干预作用，即对白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜的杀灭作用。白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物对于抑制和清除白色念珠菌与变形链球菌双物种生物被膜有确切的功效，并且在抑制白色念珠菌与变形链球菌的生长方面，具有显著的效果。白屈菜红碱、血根碱和小檗碱混合物为中药成分的组合物，在抗菌、抗感染的同时可以保护机体组织器官、增强机体免疫力，并有利于降低药物的毒副作用。