技术领域

本发明涉及生物制剂领域，具体为一种具有防脱生发作用的干细胞因子复合物的制备方法。

背景技术

近年来，随着对毛发再生领域的深入研究，人们发现毛发生长受到毛囊干细胞及毛囊周围组织的综合调控。脱发疾病中大量毛囊停滞在休止期，不再进入生长期，这与调控毛囊生长的细胞因子含量降低，比例失调等因素密切相关。

干细胞在体内能通过分泌多种因子来调节组织器官的正常生理代谢。这些因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)等。常见的干细胞有脂肪干细胞、骨髓干细胞、脐带干细胞、牙龈干细胞等。其中脐带干细胞具有采集对供体无伤害、不涉及伦理问题，免疫原性较低等特性，脂肪干细胞则具有来源广泛、取材方便、组织损伤小等优点，是目前应用最广的两种干细胞。成纤维细胞则是真皮层的主体细胞，由胚胎时期的细胞分化而来，具有干细胞的特性，可大量合成及分泌蛋白质。毛囊主体位于真皮层，紧邻皮下脂肪层，真皮及皮下脂肪组织都参与其生长发育及周期调控。联合真皮层细胞和脂肪来源细胞模拟毛囊在体内的生存环境，可促进干细胞合成和分泌更接近于体内正常比例的细胞因子复合物。而低剂量的UVB照射则能明显增加细胞的分泌、迁移和存活的能力。

因此，将成纤维细胞和脂肪干细胞的条件培养基混合，用于培养脐带干细胞，可以较好的模拟毛囊中的干细胞在体内的生长环境。低剂量UVB刺激则能进一步促进脐带干细胞分泌更多促进毛囊进入正常周期循环的细胞因子复合物。富集该干细胞因子复合物，用于脱发部位细胞因子的补充和调节，能从根本上修复损伤头皮，调节毛囊健康，促进毛发生长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有防脱生发作用的干细胞因子复合物的制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种具有防脱生发作用的干细胞因子复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)细胞原代的分离与扩大培养，具体如下：

A：人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)的原代分离与扩大培养；

B：人成纤维细胞(human fibroblast，hFB)的原代分离与扩大培养；

C：人脐带干细胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UC-MSC)的原代分离与扩大培养；

(2)脂肪干细胞与成纤维细胞混合条件培养基的准备，具体包括以下步骤：

D：将(1)中所得脂肪干细胞/成纤维细胞各自按3～7×105个/瓶接种于75cm2培养瓶中；

E：正常培养3～5d后收集上清，得到两种条件培养基；

F：用0.22μm滤器过滤除去细胞碎片及其他较大粒径的颗粒；

G：BCA法测定两种条件培养基的蛋白浓度，根据其蛋白含量进行混合，得到混合条件培养基；

(3)脐带干细胞的处理，将(1)所得脐带干细胞以2～6×105个/皿接种于10cm培养皿中，正常培养24h后，弃去培养液，PBS清洗两次后，进行处理，具体方法为加入1～2ml PBS覆盖细胞，用10～50mJ/cm2 UVB照射10s～2min后弃去PBS，加30％～70％的步骤(2)中收集的混合条件培养基和70％～30％的新鲜培养基，继续37℃、5％CO2正常培养；

(4)干细胞因子复合物的制备，具体步骤如下：

步骤(3)处理后，细胞正常培养3～5d，收集上清；用0.22μm滤器过滤，除去细胞碎片及其他较大粒径的颗粒；用超滤浓缩技术对收集到的条件培养基进行浓缩，即得到干细胞因子复合物；

(5)对步骤(4)中得到的干细胞因子复合物进行功效验证。

优选的，在步骤(2)中，脂肪干细胞条件培养基和成纤维细胞条件培养基按一定比例混合后用于培养脐带干细胞，两者蛋白含量比例范围1：9～7：3。

优选的，在步骤(2)中，使用的脂肪干细胞、脐带干细胞，成纤维细胞选用3～12代中的一种或多种。

优选的，在步骤(3)中，UVB照射强度为10～50mJ/cm2，照射时间为10s～2min，照射细胞类型包括但不限于脐带干细胞。

优选的，在步骤(4)中，所得干细胞因子复合物总蛋白浓度为0.5～2.0mg/mL；pH计测定干细胞因子复合物pH值，范围为6.5～8.0。

优选的，在步骤(5)中的验证指对(4)中所得干细胞因子复合物进行毛囊激活功效的验证。

优选的，在步骤(5)中的验证采用分组验证方法。

优选的，所述干细胞因子复合物适用于雄激素脱发、烫染损伤等多种脱发疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明制备的干细胞因子复合物可以从恢复毛囊正常生长调控的角度解决脱发问题：采用脂肪干细胞和成纤维细胞的混合条件培养基培养脐带干细胞，可以在一定程度上模拟毛囊中的干细胞在体内环境下的生存代谢过程。在低剂量UVB刺激下，促进脐带干细胞分泌更多、更接近自然比例，有益毛囊正常周期循环的细胞因子复合物，从根本上调节毛囊健康，促进毛发再生，效果更持久。

2、本发明制备的干细胞因子复合物，细胞取材方便：临床上分娩所得脐带/抽脂术所得脂肪/环切术所得新生儿包皮均属于医疗废弃物，来源广泛，便于产业化。

3、本发明制备的干细胞因子复合物，富含血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)等，种类丰富，含量高。

附图说明

图1为本发明的整体流程图；

图2是本发明实施例制备的干细胞因子复合物中各种因子的含量。

图3是本发明实施例制备的干细胞因子复合物对毛囊激活相关基因的影响。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明所述方法，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种技术方案：一种具有防脱生发作用的干细胞因子复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)细胞原代的分离与培养，具体包括以下步骤：

A：ADSCs的原代分离与扩大培养；

无菌条件下，将抽脂获得的脂肪去除结缔组织，剪成1mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，加入等体积生理盐水进行清洗，200g，常温离心5min；去除液体部分，在脂肪颗粒中加入等体积的0.1％胶原酶溶液，恒温震荡消化30min，100g，常温离心5min；去除上清，取细胞沉淀，生理盐水清洗一遍，用α-MEM完全培养液重悬，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，正常传代扩增；

B：hFB的原代分离与扩大培养；

取临床来源新生儿包皮组织,转移到超净工作台中，75％酒精浸泡1min，用含两倍双抗的PBS清洗3次；去除皮下脂肪组织，剪成1mm3左右的小块；用无菌毛细管在25cm2培养瓶底面滴加一层胎牛血清，再将包皮组织小块用镊子转移至细胞培养瓶底部，每个培养瓶均匀接种30个组织小块；37℃,5％CO2条件下培养；待组织块贴壁牢固后，在培养瓶中补加4mlα-MEM完全培养基，继续培养，3d换液，待细胞长满后，进行传代扩增；

C：UC-MSC的原代分离与扩大培养；

在超净工作台内，将脐带剪成5cm左右的小段，用PBS洗净脐带表面残余的血液；剥离脐动脉和脐静脉后，将脐带置于含双抗的α-MEM培养基中，剪成2mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，200g离心；小心弃去上层培养基，加入与组织等体积的混合消化酶，置于37℃摇床中，振荡消化1.5h。混合消化酶含Ⅱ型胶原酶2g/L、中性蛋白酶0.8g/L、透明质酸酶0.03g/L；将消化后的组织液于300g离心5min，小心弃去上清，PBS洗1次，弃上清，沉淀用α-MEM完全培养基重悬，接种于75cm2培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱中培养，传代扩增；

(2)脂肪干细胞与成纤维细胞混合条件培养基的准备，具体包括以下步骤：

D：将(1)中所得脂肪干细胞/成纤维细胞按3×105个/瓶接种于75cm2培养瓶中，使用的脂肪干细胞和成纤维细胞选用第6代细胞；

E：正常培养3d后收集上清，得到两种条件培养基；

F：用0.22μm滤器过滤除去细胞碎片及其他较大粒径的颗粒；

G：用BCA法测定两种条件培养基的蛋白浓度，根据其蛋白含量，按1:1的比例进行混合，得到混合条件培养基；

(3)脐带干细胞的处理，将(1)所得第4代脐带干细胞以3×105个/皿接种于10cm培养皿中，正常培养24h后，弃去培养液，PBS清洗两次后，进行处理，具体方法为加入2ml PBS覆盖细胞，用30mJ/cm2 UVB照射40s后弃去PBS，加40％的(2)中收集的混合条件培养基和60％的新鲜培养基，继续37℃、5％CO2正常培养；

(4)干细胞因子复合物的制备，具体步骤如下：

步骤(3)处理后，细胞正常培养3d，收集上清；用0.22μm滤器过滤，除去细胞碎片及其他较大粒径的颗粒；用超滤浓缩技术对收集到的条件培养基进行浓缩，即得到干细胞因子复合物，所得干细胞因子复合物总蛋白浓度为0.6mg/mL；pH计测定干细胞因子复合物pH值为7.2；通过Elisa实验检测干细胞因子复合物中血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的含量，结果如图2所示。

(5)对步骤(4)中得到的干细胞因子复合物进行功效验证。采用分组验证方法，对步骤(4)所得干细胞因子复合物进行毛囊激活功效的验证，将毛囊干细胞(P9代)以0.5×105个/孔接种于6孔板中，培养过夜，弃去培养液，PBS清洗一次后，分组处理，组别包括对照组、UVB组、干细胞因子复合物添加组(CM组)、UVB+CM组。对照组正常培养毛囊干细胞，UVB组在培养时增加UVB照射处理，CM组加干细胞因子复合物处理、UVB+CM组为UVB和干细胞因子复合物同时处理。其中UVB照射处理为加入1ml PBS覆盖细胞，用UVB30mJ/cm2照射1min，后弃去PBS，正常培养。干细胞因子复合物处理为用40％的步骤(4)中收集的干细胞因子复合物和60％的新鲜培养基，对毛囊干细胞进行培养；

分组处理后，继续培养3d，用Trizol试剂盒提取每组细胞的RNA，反转录得到cDNA为模板，通过荧光定量PCR实验检测毛囊干细胞激活相关基因的表达量；

实验结果：

通过荧光定量PCR的方法，对不同处理条件下毛囊干细胞激活相关基因如wnt10b，β-catenin，LEF-1，cyclin D1，GSK3β，c-myc的表达量进行检测；结果显示，UVB+CM组wnt10b，β-catenin，LEF-1，cyclin D1的表达量显著增高，而GSK3β，c-myc的表达量降低，如图3所示。说明本发明制备的干细胞因子复合物可以从恢复毛囊正常生长调控的角度解决脱发问题。

上述实施例为本发明的优选实施例，本发明的保护范围由所附权利要求及其等同物限定，不受上述实施例的限制，在不脱离本发明精神和范围的前提下会有各种改进和变化，因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有变化和修改。