技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种蛋白激酶类抑制剂8-溴-2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-[(4-苯氧基苯基)氨基]吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮(常用名为G-749)在制备抗真菌药物中的应用。

背景技术

G-749是一个新型的FMS样的酪氨酸激酶3(Fms-like tyrosine kinase 3，Flt3)抑制剂，在白血病细胞中，G-749通过诱导细胞凋亡显示出抗增殖活性。目前处在临床研究的候选药物中，约20％-30％的药物为蛋白激酶类抑制剂。虽然蛋白激酶类抑制剂在肿瘤、糖尿病、风湿病等领域被广泛研究，在抗细菌感染方面近年也有许多研究报道，但在抗真菌感染领域研究较少。目前国内外未见G-749抗真菌作用的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种G-749在制备抗真菌药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

G-749在制备抗真菌药物中的应用。

优选的，所述真菌为敏感真菌菌株或耐药真菌菌株。

进一步的，所述敏感真菌菌株为对氟康唑敏感的敏感真菌菌株，所述耐药真菌菌株为对氟康唑耐受的耐药真菌菌株。

优选的，所述真菌为克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)、耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌或热带念珠菌。

优选的，G-749的MIC值为16μg/mL。

一种抗真菌药物，由G-749与药用辅料制成。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过体外细胞实验表明，G-749对耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、新生隐球菌、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌具有不同程度的抗真菌甚至是杀真菌作用，因此可将G-749用作抗真菌药物。本发明为G-749开辟了新的用途，将其用于制备抗真菌药物，为真菌感染治疗提供了新的候选药物。目前临床上抗真菌谱广且具有杀真菌活性的药物非常少，在临床真菌耐药性日趋普遍、耐药程度日趋严重的情况下，G-749的抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，为临床高效治疗真菌甚至是耐药真菌的感染，提供新的治疗途径。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明提出一种G-749在制备抗真菌药物中的应用，其中：所述G-749为蛋白激酶类抑制剂(Flt3抑制剂)8-溴-2-[(1-甲基-4-哌啶基)氨基]-4-[(4-苯氧基苯基)氨基]吡啶并[4,3-d]嘧啶-5(6H)-酮，CAS号为1457983-28-6。

本发明中，所述真菌包括克柔念珠菌(ATCC2340)、光滑念珠菌(ATCC2281)、新生隐球菌(32609)、耐药白念珠菌(103)、敏感白念珠菌(SC5314)、近平滑念珠菌和热带念珠菌。

本发明中，所述耐药菌株是对氟康唑耐受，敏感菌株是对氟康唑敏感。

实施例1 G-749对不同真菌的作用

材料和方法

1.试药：

G-749(CAS号为1457983-28-6)：购于上海丹荃医药科技有限公司，纯度≥99％。

氟康唑：sigma公司，批号036M4709V。

二甲亚砜(DMSO)：天津市天力化学试剂有限公司。

各试药用DMSO配制，置于-20℃保存。实验前，将药物取出置于35℃温箱融化，充分混匀。

2.菌株：

使用的菌株：包括1)敏感菌株：敏感白念珠菌(SC5314)，近平滑念珠菌(22019)，新生隐球菌(32609)；2)耐药菌株：耐药白念珠菌(103)，耐药热带念珠菌，天然耐药克柔念珠菌(ATCC2340)，天然耐药光滑念珠菌(ATCC2281)。菌株均惠赠于第二军医大学姜远英老师课题组，并经形态学和生化学鉴定。

所有实验用菌株均于沙堡葡萄糖琼脂培养基(SDA)划板活化，白念珠菌、热带念珠菌、新生隐球菌等球状菌于35℃培养2-3天后，分别挑取单克隆再次划板活化，取第二次所得单克隆置SDA斜面，用上述方法培养后于4℃保存备用。

3.培养液：

1)RPMI 1640液体培养液：

RPMI1640(Gibco)10g，NaHCO3 2.0g，吗啡啉丙磺酸(Sigma)34.5g(0.165mol)，加三蒸水900mL溶解，1mol/L NaOH调pH至7.0，三蒸水定容至1000mL，0.22μm微孔滤膜(Millipore)过滤除菌，分装后于4℃保存备用。

2)沙堡葡萄糖琼脂固体培养基(SDA)：

蛋白胨10g，葡萄糖40g加三蒸水900mL溶解，加琼脂18g，调整pH至7.0，以三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。

3)YEPD培养液：

酵母浸膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，加三蒸水900mL溶解，三蒸水定容至1000mL，高压灭菌(121℃，20min)后于4℃保存备用。

4.仪器设备：

GHP-9080型隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；

THZ-98C型恒温震荡箱(上海一恒科学仪器有限公司)；

SW-CT-IF型超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)。

5.G-749和氟康唑贮备液：

将购得的G-749称量，溶解于适量二甲基亚砜，配制成6.4mg/mL的药物溶液，放进冰箱-20℃备用。

氟康唑用DMSO溶解，配成浓度为6.4mg/mL，于-20℃保存备用。

6.菌液制备：

实验前，用接种圈从4℃保存的SDA培养基上分别挑取各球状真菌少量，分别接种至1mL YEPD培养液，于35℃，200rpm振荡培养，活化16h，使真菌处于指数生长期后期。然后将各菌液分别加至1mL YEPD培养液中，用上述方法再次活化，培养16h，用血细胞计数板计数，以RPMI 1640培养液分别调整各菌液浓度至1×103～5×103CFU/mL。

7.药敏板制备：

各菌株分别取无菌96孔板一块，于每排1号孔加RPMI 1640液体培养基100μL作空白对照；3～12号孔各加上述新鲜配制的菌液100μL；2号孔加菌液200μL；12号孔不含药物，只加菌液100μL作阳性生长对照。在每排的2号孔加母液浓度为6.4mg/mL的G-749或氟康唑各2μL。

对2～11号孔进行10级倍比稀释，使各孔的最终G-749和氟康唑浓度为64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.125μg/mL。各孔中DMSO含量均低于1％。将各药敏板于35℃恒温箱培养。

8.MIC值判定：

在35℃恒温箱中培养24h，观察实验结果，并确定其MIC值。观察结束后，放回恒温培养箱中，继续培养。当药物的MIC值超过测定浓度范围时，按以下方法进行统计：MIC值高于最高浓度64μg/mL时，计为“>64μg/mL”；MIC值为最低浓度或在最低浓度以下时，不作区别，均计为“≤0.125μg/mL”。上述实验均平行操作3次，当MIC值能准确重复或只差一个浓度时才被接受，并以较高浓度作为MIC值；当MIC值相差两个浓度以上时，则需重新实验，直到符合要求为止。实验结果见表1。

表1 G-749对各种真菌的MIC值(μg/mL)

由表1可见，G-749作用各种真菌24h后，对7种真菌(耐药白念珠菌、敏感白念珠菌、克柔念珠菌、光滑念珠菌、新生隐球菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌)的MIC值均为16μg/mL，这显示了G-749具有较广谱的抗真菌作用。

实施例2 G-749对各种真菌存活的影响

实验方法：

1、药物，菌株，材料同实施例1

2、实验步骤：

实验前，从4℃保存的SDA培养基上挑取菌克隆少量，接种至1mLYEPD培养液，于35℃，200rpm振荡培养16h，使真菌处于指数生长期后期。以RPMI1640培养液稀释并调整菌液浓度至1×105CFU/mL。分别于上述菌液中加入氟康唑使其终浓度为64μg/mL，化合物G-749终浓度为8μg/mL、16μg/mL和32μg/mL，空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于0.5％。于35℃孵箱中，以200rpm振荡培养，分别于0h、24h，各样品分别取样，稀释不同浓度，涂铺于SDA平板，培养48小时后数克隆，计算各组的菌落存活数。实验结果见表2。

表2.G-749作用7种不同真菌后的存活菌落数(CFU/ml)

由表2可知，浓度为32μg/mL的G-749作用光滑念珠菌、近平滑念珠菌、新生隐球菌24h后，菌落数由起始浓度约105CFU/ml变为103CFU/ml，这表明浓度为32μg/mL的G-749对这3种真菌均不仅具有较好的抑制生长作用，并表现杀菌活性，对7种真菌均具有不同程度的抑菌活性。

上述实验结果表明G-749具有抗真菌谱广且杀真菌活性的特点，因此可用作抗真菌药物。