技术领域

本发明属于土壤生物修复技术领域，具体涉及一种农药氯氰菊酯降解微生物菌剂及其制备方法。

背景技术

化学农药作为保障农业丰收的重要手段，在农业生产中发挥着重要的作用。化学农药使用存在的主要问题是化学农药不合理使用、农产品中农药残留严重超标、防治成本高，对生态环境造成了严重污染，产生了大面积药害。

微生物修复是利用特定微生物体的代谢吸收、转化、清除或降解化学农药成分，实现环境净化、生态效应恢复的生物措施，具有高效经济、无二次污染等特点。该技术已应用于各类污染领域，表现出了较高的应用价值，国内外有关行业部门专家认为是生态环境保护领域最有价值和最具生命力的处理技术，是农业污染修复的主要发展方向，也是解决化学农药污染土壤生态修复的有效手段。

发明内容

本发明的目的是提供一种农药氯氰菊酯降解微生物菌剂及其制备方法，通过生物修复的方式对农药残留土壤进行有效修复。

本发明所采用的技术方案为：

农药氯氰菊酯降解微生物菌剂的制备方法，其特征在于：

包括以下步骤：

步骤一：对草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子进行种子的斜面培养，获得草酸青霉SSCL-5孢子液；

步骤二：对草酸青霉SSCL-5孢子液进行固体发酵；

步骤三：固体发酵物干燥粉碎得到固体发酵孢子粉，与麸皮、高岭土混合制得农药氯氰菊酯降解微生物菌剂。

步骤一具体为：

制备固体斜面培养基A，并在115℃温度下灭菌30分钟，将草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子无菌操作接入培养基A，置于温度28-30℃，持续培养72-96小时，至斜面大量孢子生成；刮取草酸青霉SSCL-5孢子至新无菌容器，用无菌0.85%NaCl水溶液调节孢子浓度为5×106 个/克草酸青霉SSCL-5孢子液备用。

种子斜面培养基A的配方为：

葡萄糖 1.0-2.5克，蛋白胨 5.0-8.0克，磷酸二氢钾0.5-1.5克，硫酸镁0.2-0.8克，琼脂 1.5-1.8克，加水至 100毫升。

步骤二具体为：

制备固体培养基B，并进行常灭菌处理后，无菌操作加入步骤一所获得的草酸青霉SSCL-5孢子液1-2毫升至培养基B，混匀，恒定温度28±5℃，相对湿度含量35%-55%，持续发酵144-168小时，孢子计数1.0-3.0×109个/克时终止发酵。

固体发酵培养基B的配方为：

固体培养基B：麦麸80-150克，稻壳20-40克，豆粕0.5-1.5克，植物油 2-10毫升，大米粉4.0-10.0克，加水80-100克。

步骤三具体为：

将步骤二获得的固体发酵物置于恒温35-40 ℃干燥器中，通风干燥24-48小时，待其含水量为8-12%时停止。收集干燥物于气流粉碎机中，按照工作5-10分钟、停止2-4分钟间歇模式进行粉碎至60目-100目大小。菌剂制备：固体发酵孢子粉：麸皮：高岭土=1：4-6：2-6，搅拌混合均匀，获得固体制粉状制剂即目的产品。

所述草酸青霉SSCL-5于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16797。保藏地址为中国北京。

如所述的制备方法制得的农药氯氰菊酯降解微生物菌剂。

如所述的农药氯氰菊酯降解微生物菌剂的应用，其特征在于：

所述农药氯氰菊酯降解微生物菌剂用于降解土壤中残留的氯氰菊酯。

本发明具有以下优点：

本发明是一种高效、经济的环境友好型土壤修复技术，核心技术是高效降解菌株的筛选和功能菌剂的制备，本发明使用的草酸青霉SSCL-5对氯氰菊酯降解可达到90%以上。

本发明是操作简单、修复效果好、成本费用低、不影响农业生产的土壤修复技术，相比其他方法具有处理成本低、施工简单、无二次污染、对环境影响小等优点。对恢复农业土壤的生态平衡和生产力具有良好效果。生物修复技术在化学农药污染治理的应用，能有效改善农田土壤环境，同时，对于保护农产品安全，推动农产品的绿色化、有机化及农田土壤的可持续发展具有良好的经济、社会效益。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行详细的说明。

本发明涉及一种农药氯氰菊酯降解微生物菌剂的制备方法，包括以下步骤：

步骤一：对草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子进行种子的斜面培养，获得草酸青霉SSCL-5孢子液；

步骤二：对草酸青霉SSCL-5孢子液进行固体发酵；

步骤三：固体发酵物干燥粉碎得到固体发酵孢子粉，与麸皮、高岭土混合制得农药氯氰菊酯降解微生物菌剂。

步骤一具体为：

制备固体斜面培养基A，并在115℃温度下灭菌30分钟，将草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子无菌操作接入培养基A，置于温度28-30℃，持续培养72-96小时，至斜面大量孢子生成；刮取草酸青霉SSCL-5孢子至新无菌容器，用无菌0.85%NaCl水溶液调节孢子浓度为5×106 个/克草酸青霉SSCL-5孢子液备用。

种子斜面培养基A的配方为：

葡萄糖 1.0-2.5克，蛋白胨 5.0-8.0克，磷酸二氢钾0.5-1.5克，硫酸镁0.2-0.8克，琼脂 1.5-1.8克，加水至 100毫升。

步骤二具体为：

制备固体培养基B，并进行常灭菌处理后，无菌操作加入步骤一所获得的草酸青霉SSCL-5孢子液1-2毫升至培养基B，混匀，恒定温度28±5℃，相对湿度含量35%-55%，持续发酵144-168小时，孢子计数1.0-3.0×109个/克时终止发酵。

固体发酵培养基B的配方为：

固体培养基B：麦麸80-150克，稻壳20-40克，豆粕0.5-1.5克，植物油 2-10毫升，大米粉4.0-10.0克，加水80-100克。

步骤三具体为：

将步骤二获得的固体发酵物置于恒温35-40 ℃干燥器中，通风干燥24-48小时，待其含水量为8-12%时停止。收集干燥物于气流粉碎机中，按照工作5-10分钟、停止2-4分钟间歇模式进行粉碎至60目-100目大小。菌剂制备：固体发酵孢子粉：麸皮：高岭土=1：4-6：2-6，搅拌混合均匀，获得固体制粉状制剂即目的产品。

所述草酸青霉SSCL-5（Penicillium oxalicum）于2018年12月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.16797。

上述制备方法制得的农药氯氰菊酯降解微生物菌剂，可用于降解土壤中残留的氯氰菊酯，对土壤中残留氯氰菊酯降解可达到90%以上，具有处理成本低、施工简单、无二次污染、对环境影响小等优点。

实施例1：

步骤一：种子的斜面培养

制备固体斜面培养基A，并进行灭菌处理（115℃，灭菌30分钟），将草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子无菌操作接入培养基A，置于温度28℃，持续培养96小时，至斜面大量孢子生成；刮取SSCL-5孢子至新无菌容器，用无菌0.85%NaCl水溶液调节孢子浓度为5×106个/克草酸青霉SSCL-5孢子液备用。

种子斜面培养基A的配方如下：

葡萄糖 1.0克，蛋白胨8.0克，磷酸二氢钾1.5克，硫酸镁0.2克，琼脂 1.5克，加水至 100毫升。

步骤二：菌种的固体发酵

制备固体培养基B，并进行常规灭菌处理后，无菌操作加入步骤一所获得的草酸青霉SSCL-5孢子液 1毫升至培养基B，混匀，恒定温度28±5℃，相对湿度含量35%-55%，持续发酵144小时，孢子计数1.0×109个/克时终止发酵；

固体培养基B：麦麸80克，稻壳20克，豆粕1.5克，植物油 2毫升，大米粉10.0克，加水80克。

步骤三：制剂制备

将步骤二获得的固体发酵物置于恒温38 ℃干燥器中，通风干燥24小时，待其含水量为12%时停止。收集干燥物于气流粉碎机中，按照工作10分钟、停止4分钟间歇模式进行粉碎至60目-100目大小。菌剂制备：固体发酵孢子粉：麸皮：高岭土=1：6：2，搅拌混合均匀，获得固体制粉状制剂即目的产品。

实施例2：

步骤一：种子的斜面培养

制备固体斜面培养基A，并进行灭菌处理（115℃，灭菌30分钟），将草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子无菌操作接入培养基A，置于温度30℃，持续培养72小时，至斜面大量孢子生成；刮取SSCL-5孢子至新无菌容器，用无菌0.85%NaCl水溶液调节孢子浓度为5×106个/克草酸青霉SSCL-5孢子液备用。

种子斜面培养基A的配方如下：

葡萄糖 1.5克，蛋白胨 6.0克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.5克，琼脂 1.8克，加水至 100毫升。

步骤二：菌种的固体发酵

制备固体培养基B，并进行常规灭菌处理后，无菌操作加入步骤一所获得的草酸青霉SSCL-5孢子液2ml至培养基B，混匀，恒定温度28±5℃，相对湿度含量55%，持续发酵144小时，孢子计数1.0×109个/克时终止发酵；

固体培养基B：麦麸150克，稻壳40克，豆粕0.5克，植物油 8毫升，大米粉4.0克，加水90克。

步骤三：制剂制备

将步骤二获得的固体发酵物置于恒温40 ℃干燥器中，通风干燥48小时，待其含水量为8%时停止。收集干燥物于气流粉碎机中，按照工作5分钟、停止2分钟间歇模式进行粉碎至100目大小。菌剂制备：固体发酵孢子粉：麸皮：高岭土=1：4：6，搅拌混合均匀，获得固体制粉状制剂即目的产品。

实施例3：

步骤一：种子的斜面培养

制备固体斜面培养基A，并进行灭菌处理（115℃，灭菌30分钟），将草酸青霉SSCL-5菌丝或孢子无菌操作接入培养基A，置于温度29℃，持续培养72小时，至斜面大量孢子生成；刮取SSCL-5孢子至新无菌容器，用无菌0.85%NaCl水溶液调节孢子浓度为5×106个/克草酸青霉SSCL-5孢子液备用。

种子斜面培养基A的配方如下：

葡萄糖 2.5克，蛋白胨 8.0克，磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.8克，琼脂 1.8克，加水至 100毫升。

步骤二：菌种的固体发酵

制备固体培养基B，并进行常规灭菌处理后，无菌操作加入步骤一所获得的草酸青霉SSCL-5孢子液1毫升至培养基B，混匀，恒定温度28±5℃，相对湿度含量45%，持续发酵150小时，孢子计数2.0×109个/克时终止发酵；

固体培养基B：麦麸80克，稻壳40克，豆粕1.5克，植物油 2毫升，大米粉10.0克，加水100克。

步骤三：制剂制备

将步骤二获得的固体发酵物置于恒温40 ℃干燥器中，通风干燥40小时，待其含水量为11%时停止。收集干燥物于气流粉碎机中，按照工作6分钟、停止3分钟间歇模式进行粉碎至60目大小。菌剂制备：固体发酵孢子粉：麸皮：高岭土=1：6：2，搅拌混合均匀，获得固体制粉状制剂即目的产品。

本发明涉及的菌剂在温度25-34℃，湿度40-60%，氯氰菊酯含量在50mg/kg土壤条件下，每亩施用5kg，一个月之后土壤内氯氰菊酯残留量可下降94%以上。对于氯氰菊酯含量达400mg/kg的土壤，每亩施用5kg，菌剂也能降解85%以上。

本发明的内容不限于实施例所列举，本领域普通技术人员通过阅读本发明说明书而对本发明技术方案采取的任何等效的变换，均为本发明的权利要求所涵盖。