技术领域

本发明属于有机硒测量技术领域，涉及一种酵母中有机硒的测定方法。

背景技术

作为人体必须的微量元素之一，硒通常被认为是具有“双刃剑”特性的。自从1932年美国一群羊吃了含硒量高的牧草而中毒死亡，1857年美国军马因高硒牧草中毒死亡2次事件发生后，几十年间人们对于硒的研究一直集中在硒的毒性方面。食物中硒含量因此也成为一种被监控的食品安全指标。一个世纪之后有人发现对肝脏起着重要的保护作用的是含硒的化合物。1973年科学家发现硒是谷胱甘肽过氧化酶的必需成分，从而揭示了硒的第一个生物活性形式(Rotruck,J.T.,et al.Selenium:biochemical role as a componentof glutathione peroxidase[J].Science(New York,NY)179.4073(1973):588-590.)。从此硒的正向生理意义才引起科学家们的重视。此后大量研究也表明了硒对人体健康非常重要的生理作用，认识到土壤环境中硒元素的多少与人体健康息息相关。同年(1973年)世界卫生组织(WHO)宣布，硒是人和动物正常生命活动中必不可少的微量元素。

资料报道，硒对人体健康起着极其重要的作用。比如具有免疫监视作用，预防抑制肿瘤发生，被称为抗癌之王；具有抵抗病毒保护肝脏的作用，被称为肝病天敌；具有预防心脑血管疾病作用，被喻为心脏守护神；具有解毒、排铅、抗辐射能力，被喻为天然解毒剂；具有恢复胰岛功能、降低血糖，被喻为微量元素中的胰岛素；可以提高生殖系统功能，被称为生命天使，还具有改善视力、提高记忆力、防治风湿骨痛、呼吸、胃肠疾患等多种功能。

与人体其它必需微量元素相比，硒在世界各地地壳中的分布极不均匀，高硒地区会因为高浓度摄入硒元素而导致中毒，而缺硒地区因为硒摄入量不足会导致克山病、大骨节病等地方性疾病。但总的来说，全世界2/3的地区是缺硒区域。我国72％的地区缺硒。因此补硒产品便应运而生。

研究表明酵母中的有机硒比无机硒有更好的生物利用度和活性。在人体和动物实验表明，富硒酵母和硒代蛋氨酸的生物利用度大约是无机形式的硒的1.5～2倍，也没有致畸和致突变副作用(Scientific Opinion of the Panel on Food Additives,Flavourings,Processing Aids and Materials in Contact with Food(AFC)on arequest from the Commission on Selenium-enriched yeast as source for selenium[J].The EFSA Journal.2008,766,1-43.)，是国际上公认的人和动物理想的硒补充形式。

2011年1月24日我国卫生部发布第3号公告称：决定取消GB2762-2005《食品中污染物限量》中硒指标，从此硒不再作为食品污染物或者有毒物进行监管。这一政策反映了国家对于硒元素的食用导向。但在国家取消硒的限量标准，新的监管措施尚未出台情况下，有的地方或企业在产品中直接添加无机硒冒充天然有机硒产品上市销售，有的给黄豆粉中添加无机硒冒充所谓的富硒酵母售卖，有的将普通酵母当做富硒酵母上市，等等。这些不良商家的行为给市场造成了混乱，给消费者带来了安全隐患。

为了甄别酵母补硒产品的真伪和品质，我们必须对产品中的无机硒和有机硒进行分别测定，用数据揭穿商品的本质和优劣。

富硒酵母中硒不仅仅是有机硒，还有一些被吸收进细胞还未同化的无机硒(刘曼西等.硒酵母成分的研究[J].华中工学院学报,1985(3):117-121.)。因此大量服用富硒酵母也会导致毒副作用(于英杰等.富硒酵母安全性试验研究[J].畜牧与兽医,2006,38(9):38-40.)。因此，富硒酵母中有机硒和无机硒的检测是由来已久的科研课题。

酵母硒存在于细胞内，无论无机硒、有机硒还是总硒的检测，都必须首先将酵母细胞完全彻底地破碎释放胞内物质再行检测。但由于酵母细胞壁结构紧密，细胞的彻底破碎始终是科学家难以解决的难题。有些化学方法如强碱法强酸法可以很好溶解酵母细胞壁上的多糖从而裂解细胞，达到有效破碎细胞的目的，但这些强酸强碱试剂常常导致氨基酸和蛋白质结构的破坏，进而导致半胱氨酸上的巯基解离，或者甲硫氨酸上的硫甲基解离而丢失，硒是比巯更为活泼的元素，硒氢基或硒甲基因而更容易受酸碱影响而解离，造成有机硒结构的破坏，最终导致有机硒和无机硒的测定结果误差。因此理想的细胞破碎方法应该是物理方法。然而目前还没有一种物理方法可以百分之百地彻底破碎细胞。细胞不能彻底破碎将造成测定结果的巨大误差。因此很多研究致力于高破碎率的方法学研究(姚洪文等.酵母细胞破碎技术的研究[J].中国酿造,2005,24(4):32-34；衣海龙.利用超声波法破碎啤酒酵母细胞壁的工艺研究[J].酿酒,2015(4):83-85.)，但结果依然不尽人意。

在细胞破碎后，细胞内容物将释放于我们要检测的对象于混合液中。要对其中的无机硒和有机硒进行分别测定，就必须将二者分离，之后才能分别进行测定。在我国目前有关硒检测方法的国家标准中，都是关于总硒的，尚未涉及无机有机硒分别检测方法。

地标DB3301/T 117-2007《稻米中有机硒和无机硒含量的测定》和行业标准GH/T1135-2017《富硒农产品》检测方法中涉及的是稻米中硒的分类检测，样品预处理是将大体积稻米粉碎过筛获得检测试样，不涉及细胞破碎方法，因此均不适用于酵母细胞中硒的测定。

研究中的科研文献多数根据成熟方法测定总硒，再通过尽可能高效的细胞破碎方法破碎细胞，进而将混合液中的有机硒和无机硒分离，分别测定分离样中的无机硒和有机硒含量，或者通过总硒和无机硒差减，得到有机硒的含量。

首先是酵母细胞破碎方法研究，但截止目前尚无理想的破碎方案。通过反复冻融法破碎酵母细胞的破碎率仅仅只有30～40％(郭卫芸等.反复冻融法破壁啤酒废酵母的研究[J].酿酒科技,2009,2009(3):103-105.)；通过超声破碎酵母细胞，其破碎率也只有60～70％(衣海龙.利用超声波法破碎啤酒酵母细胞壁的工艺研究[J].酿酒,2015(4):83-85.)，通过以上两种方法的结合酵母细胞的破碎率能够达到89.13％(苑华宁等.反复冻融和超声协同作用破碎酵母细胞[J].食品与发酵工业,2013,39(12):62-67.)，而采用破碎率更高的超高压均质破碎技术酵母细胞破碎率也只能达到93.04％，我们后来的实验也验证了以上这些数据。如果无法实现酵母细胞的100％破碎，细胞内容物包括细胞中各种形态的硒，也就无法完全释放，进而导致酵母细胞无机硒和有机硒含量测定结果不准确。

第二方面是有机硒和无机硒分离方法研究。要分别测定试样中有机硒和无机硒就首先要将无机硒和有机硒进行分离。不少科学家致力于有机硒和无机硒的分别检测。郝素娥建立了酵母硒中有机硒测定方法，采用研磨法破碎细胞，采用透析法分离有机硒和无机(郝素娥等.硒酵母中有机硒及硒代氨基酸含量的测定方法[J].分析测试学报,1999,18(3):72-74)；但透析会失去试样中的小分子氨基酸，包括硒代硫氨基酸，最终导致有机硒测定结果错误。作者论文数据(原文表1)有机硒含量远远低于硒代硫氨基酸之和就说明透析分离法是不合理的。叶韵青未进行细胞破碎，直接采用浓盐酸溶解细胞后脱脂棉过滤，将滤液作为无机硒(叶韵青.富硒酵母类保健食品中有机硒测定方法[J].轻工科技,2013(4):7-8)，这个方法中，脱脂棉滤液中不仅含有无机硒，因此过滤原理是按照分子量过滤的，因此理论上也会含有硒代硫氨基酸小分子，因此将会带来测定结果的误差；还有人采用乙醇萃取酵母细胞中的有机硒但却未行细胞破碎(施宏景等.富硒酵母类保健食品中有机硒测定方法研究[J].安徽预防医学杂志,2010(5):416-416)，但乙醇能否完全萃取完整细胞中的有机硒并无研究资料支持。

申请号为CN201710031377.7的专利方法(一种测定富硒酵母中无机硒和有机硒含量的方法)有着与本发明一模一样的目的，但该方法采用强碱和强酸处理酵母细胞，理论上会使得结合在氨基酸上有机硒解离而成为游离的无机硒，导致硒代硫氨基酸破坏，最终导致有机硒测定结果偏低。

近些年有人使用超声破碎酵母细胞，使细胞释放内容物，再利用有机溶剂萃取有机硒，测定无机相，利用差减法测定酵母中有机硒含量(刘慧堂等.保健食品中有机硒和无机硒分离检测条件探究[J].食品科技，2016，(10)：273-276)。这个思路是很不错的思路，为我们的研究提供了借鉴。但可惜的是，作者没有考虑酵母细胞破碎即便是使用超声破碎也依然是不能完全被破碎的，这将导致测定结果的不正确。

无论是学术讨论还是商业含硒商品的申报与审核和监管，都无法回避有机硒含量的问题。所以本发明在前人工作基础上，率先提出了用总硒溶出率Rd替代细胞破碎率的思路，并用Rd对测定结果进行矫正，大大提高了测定结果的重复性，缩小了偏差，使测定结果准确性大大提高。此外，给出了两步法有效分离有机硒和无机硒的方法，使酵母细胞中有机硒和无机硒分别测定成为可能，依此可以制备酵母细胞有机硒检测试剂盒和操作说明等，具有很好的应用前景，对市场上富硒酵母产品的监管有着重要价值和意义。

发明内容

为了克服上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种酵母中有机硒的测定方法，该方法提出用总硒溶出率Rd替代细胞裂解率，解决了细胞破碎率难以测定的问题，同时给出了细胞中有机硒和无机硒有效分离的方法，最终使得酵母有机硒的测定结果准确可靠。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种酵母中有机硒的测定方法，包括以下步骤：

1)采用总硒测定方法测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量，记为T；

2)采用物理破碎方法破碎酵母细胞，离心弃去未破碎的酵母细胞后收取上清液，采用总硒测定方法测定上清液中的总硒含量即溶出总硒量，记作Dt；

3)计算总硒溶出率Rd，Rd＝Dt/T，Rd在数值上等于酵母细胞破碎率；

4)对上清液中有机硒和无机硒进行分离，然后测定水相中溶出无机硒量，记为Di；利用差减法，用溶出总硒量Dt减去溶出无机硒量Di，得到溶出有机硒量，记为Do，Do＝Dt-Di；

5)采用步骤3)计算得到的总硒溶出率Rd矫正步骤4)计算得到的溶出无机硒量和溶出有机硒量；矫正溶出有机硒量Do，得到酵母有机总硒量O＝Do/Rd；则有酵母无机总硒量I＝T-O。

优选地，对酵母细胞进行物理破碎的方法包括冷冻研磨法、超声波破碎法、超高压破碎法和反复冻融法中的一种或几种。

进一步优选地，所述的冷冻研磨法，是先将酵母细胞在液氮中冷冻或在低温冰箱中冷冻，然后对冷冻的细胞进行研磨粉碎。

进一步优选地，所述的超声波破碎法，采用的超声波功率条件为300～1500J。

进一步优选地，所述的超高压破碎法，其特征在于，超高压破碎法采用的压力条件为7.5～15kMPa。

进一步优选地，所述的反复冻融法，其特征在于，将酵母细胞冷冻在液氮中或低温冰箱，待冻成冰块后在50～100℃条件下加热10～20分钟；或者，在微波炉中加热融解，微波功率500～1000W，时间3～10分钟，反复冻融，次数为3～5次。

优选地，步骤4)中，上清液中有机硒和无机硒的分离是先通过SDS-钾盐沉淀去除硒蛋白，再通过有机溶剂萃取去除含硒氨基酸小分子有机硒，最后收集水相，测定其中硒含量即为溶出无机硒量Di。

进一步优选地，对上清液中有机硒和无机硒进行分离的操作如下：

酵母破碎后离心收集上清，加入SDS使上清液中SDS终浓度为2％，充分反应后离心去除大分子蛋白沉淀；再次收集上清液加入KCl溶液使上清中KCl溶液终浓度为1mol/L，充分反应后离心去除钾盐沉淀的SDS；

收集上清液加水定容后加入环己烷充分振荡进行萃取，弃去上清液，重复加入环己烷萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准，收集水相作为无机相，测定其中硒含量，即为溶出无机硒量Di。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

1)本发明提供的酵母中有机硒测定方法，首次提出用“总硒溶出率”Rd替代细胞裂解率，并用总硒溶出率Rd对测得的破碎酵母上清液中的有机硒和无机硒含量进行矫正，最终得到更为准确的、不受酵母细胞破碎率影响的总硒含量、无机硒含量及有机硒含量。总硒溶出率Rd在数值上等于细胞裂解率，解决了长久以来细胞破碎率难以测定的问题。

2)通过与现有酵母有机硒测定方法的比较表明，本发明方法测定结果准确，精确度高，不同破碎方法即不同细胞裂解率之间无显著性差异，表明总硒溶出率Rd的引入矫正了由于酵母细胞裂解不彻底导致的测定误差，酵母细胞的裂解率不再成为影响酵母有机硒测定的因素。

3)进一步地，本发明方法在有机硒和无机硒分离过程中，既采用SDS-钾盐法沉淀裂解液中的大分子蛋白包括硒蛋白，同时采用环己烷萃取去除裂解液中的小分子有机硒，弥补了已有报道方法中多达十次以上重复萃取且难以去除大分子蛋白的缺陷，是对复杂体系中有机硒和无机硒分离方法的改良。

附图说明

图1为不同破碎方式之间矫正前后酵母中有机硒含量测定结果对比；

图2为不同破碎条件下矫正前和本发明方法测定酵母中有机硒含量对比；

图3为冻融法破碎酵母细胞条件下矫正前和本发明方法测定酵母中有机硒含量对比；

图4为酵母细胞破碎率与本发明方法有机硒测定结果对比。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本方法是对酵母细胞样品中有机硒含量进行测定的方法，在提出酵母总硒溶出率Rd在数值上等于细胞裂解率这一推论的基础上，采用不同破碎方法对细胞进行破碎，取上清液进行无机硒和有机硒的分离。在建立分离技术的基础上，对细胞总硒、裂解液中总硒和无机硒进行分别测定，利用差减法计算有机硒，用总硒溶出率(即细胞破碎率)矫正测定结果。比较不同破碎条件下改良前后的有机硒测定结果，对新建方法进行分析和评估。

实施例1

1.酵母总硒T测定

取富硒酵母干粉1g，采用GB 5009.93-2017中的第二法荧光分光光度法测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量，结果为T＝955.7μg/g干重。

2.细胞破碎

配制质量分数10％的酵母细胞母液，取3组(编号1)～3))1mL分别采用超声破碎、超高压破碎和反复冻融法破碎酵母细胞母液，具体参数如下：

1)超声破碎：用超声细胞破碎仪破碎酵母细胞，破碎条件为1500J。

2)超高压破碎：利用超高压细胞破碎仪破碎酵母细胞，破碎条件为15000Mpa。

3)反复冻融法破碎：取3组酵母细胞母液，放入液氮中冷冻10min，取出后迅速放入微波炉中解冻5min。微波炉功率750W，反复冻融5次。

3.溶出总硒Dt测定

取上述破碎后的酵母细胞裂解液，400×g离心10min去除未破碎细胞，收集上清，采用GB 5009.93-2017中的第二法荧光分光光度法分别测定酵母细胞溶出总硒Dt，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法测得的溶出总硒分别为830.3μg/g干重，507.4μg/g干重，434.5μg/g干重。

4.有机硒和无机硒的分离

各取上述上清液1mL，加入终浓度为2％的SDS混匀充分反应10min，1000×g离心1min去除SDS和大分子蛋白沉淀；收集上清，加入终浓度为1mol/L的KCl溶液反应10min，1000×g离心去除钾盐沉淀的SDS；收集上清加去离子水定容至10mL并移至分液漏斗中，加入环己烷10mL，充分震荡反应10min，去除有机相，重复多次萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准。

5.溶出无机硒Di的测定

收集步骤4中萃取后的水相，利用GB 5009.93-2017中的第二法荧光分光光度法分别测定其中的硒含量，即为溶出无机硒Di，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法测得的溶出无机硒含量分别为123.9μg/g干重，86.9μg/g干重，77.1μg/g干重。

6.有机硒(O)及其占总硒比(Po)的计算与矫正前后结果的比较

利用测得的酵母总硒T，溶出总硒Dt，根据溶出率计算公式即Rd＝Dt/T，计算溶出率Rd，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法测得的溶出率分别为86.9％，58.3％，44.76％；通过差减法计算得到溶出有机硒Do，Do＝Dt-Di，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法计算得到的溶出有机硒分别为706.3μg/g干重，339.8μg/g干重，357.4μg/g干重，最后利用总硒溶出率Dt矫正酵母细胞中的有机硒含量O，O＝Do/Dt，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法矫正后的有机硒含量分别为813.0μg/g干重，792.1μg/g干重，786.0μg/g干重。通过公式Po＝O/T计算得到有机硒在总硒中的比例，超声破碎、超高压破碎和反复冻融法3种破碎方法测得有机硒占总硒比例分别为85.1％，82.9％，82.2％。

不同破碎方式下有机硒测定的实验结果如图1，从图1可得出，矫正前各组有机硒测定结果见存在显著性差异，组间RSD为40％，远大于优良实验标准RSD≤3，通过Rd矫正后的各组有机硒测定结果间无显著性差异，组间RSD＝2％<3％，符合优良实验条件，说明本发明酵母中有机硒的测定结果不受酵母细胞破碎方法的影响。

实施例2

1.酵母总硒T测定

取富硒酵母干粉1g，采用催化分光光度法(赵军超.酵母硒、酵母铬和CoQ10发酵体系的建立和优化[D].西安：西安交通大学.2015：15-16)测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量为T＝955.7μg/g干重。

2.细胞破碎

配制质量浓度分数10％的酵母细胞母液，取6组(编号1)～6))1mL分别采用超声破碎和超高压破碎法破碎细胞，超声条件分别为1500J，900J，300J，超高压破碎条件分别为15kMPa，10kMPa，7.5kMPa。

3.溶出总硒Dt测定

取上述破碎后的酵母细胞裂解液，400×g离心10min去除未破碎细胞，收集上清，采用催化分光光度法(同步骤1)分别测定酵母细胞溶出总硒Dt，1)～6)组的测定结果分别为830.3μg/g干重，654.3μg/g干重，483.2μg/g干重，466.4μg/g干重，445.2μg/g干重，358.5μg/g干重。

4.有机硒和无机硒的分离

各取上述上清液1mL，加入终浓度为2％的SDS混匀充分反应10min，1000×g离心1min去除SDS和大分子蛋白沉淀；收集上清，加入终浓度为1mol/L的KCl溶液反应10min，1000×g离心去除钾盐沉淀的SDS；收集上清加去离子水定容至10mL并移至分液漏斗中，加入环己烷10mL，充分震荡反应10min，去除有机相，重复多次萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准。

5.溶出无机硒Di的测定

收集步骤4中萃取后的水相，采用催化分光光度法(同步骤1)分别测定其中的硒含量，即为溶出无机硒Di，1)～6)组的测定结果分别为124.0μg/g干重，98.8μg/g干重，74.2μg/g干重，83.9μg/g干重，78.8μg/g干重，63.3μg/g干重。

6.有机硒(O)及其占总硒比(Po)的计算与比较

利用测得的酵母总硒T，溶出总硒Dt，根据溶出率计算公式即Rd＝Dt/T，计算出不同破碎条件下的不同溶出率Rd，1)～6)组的Rd分别为86.9％，68.5％，50.6％，48.8％，46.6％，37.5％；通过差减法计算得到溶出有机硒Do，Do＝Dt-Di，1)～6)组的Do分别为706.3μg/g干重，555.5μg/g干重，409.0μg/g干重，382.5μg/g干重，366.4μg/g干重，295.2μg/g干重；最后利用总硒溶出率Dt矫正酵母细胞中的有机硒含量O，O＝Do/Dt，1)～6)组的有机硒含量O分别为813.0μg/g干重，811.4μg/g干重，809.0μg/g干重，783.8μg/g干重，786.5μg/g干重，787.0μg/g干重。通过公式Po＝O/T计算得到不同破碎条件下有机硒在总硒中的比例，1)～6)组测得的有机硒占总硒比例分别为85.1％，84.9％，84.6％，82.0％，82.3％，82.3％。

比较富硒酵母中通过总硒溶出率Rd矫正的有机硒含量O与未矫正的有机硒含量即溶出有机硒含量Do的测定结果，如图2所示，其中1，2，3分别为超声破碎条件1500J，900J，300J；4，5，6分别为超高压破碎条件15kMPa，10kMPa，7.5kMPa。从图中可以看出，矫正前的6组有机硒含量Do测定结果之间存在显著性差异，组间RSD为33％，远大于优良实验标准RSD≤3％，表明测定结果与破碎条件即破碎率有关；通过总硒溶出率Rd矫正的6组有机硒含量O测定结果之间无显著性差异，且各组间RSD＝2％<3％，符合优良实验条件，表明本发明所述的有机硒测定方法不受破碎条件影响。

实施例3

1.酵母总硒T测定

取富硒酵母干粉1g，采用GB 5009.93-2017中的第二法荧光分光光度法测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量，T＝955.7μg/g干重。

2.细胞破碎

配制质量分数10％的酵母细胞母液，取3组(编号1)～3))1mL放入液氮中冷冻10min，取出后迅速放入微波炉中解冻5min，微波炉功率750W，分别重复冻融5次、4次、3次。

3.溶出总硒Dt测定

取上述破碎后的酵母细胞裂解液，400×g离心10min去除未破碎细胞，收集上清，采用GB 5009.93-2017中的第二法荧光分光光度法分别测定酵母细胞溶出总硒Dt，1)～3)组的测定结果分别为434.5μg/g干重，396.2μg/g干重，248.9μg/g干重。

4.有机硒和无机硒的分离

各取上述上清液1mL，加入终浓度为2％的SDS混匀充分反应10min，1000×g离心1min去除SDS和大分子蛋白沉淀；收集上清，加入终浓度为1mol/L的KCl溶液反应10min，1000×g离心去除钾盐沉淀的SDS；收集上清加去离子水定容至10mL并移至分液漏斗中，加入环己烷10mL，充分震荡反应10min，去除有机相，重复多次萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准。

5.溶出无机硒Di的测定

收集步骤4中萃取后的水相即无机相，利用总硒T的测定方法测定其中硒含量，即为溶出无机硒Di，1)～3)组的测定结果分别为77.1μg/g干重，67.8μg/g干重，50.1μg/g干重。

6.有机硒(O)及其占总硒比(Po)的计算

利用测得的酵母总硒T，溶出总硒Dt，根据溶出率计算公式即Rd＝Dt/T，计算出不同破碎条件下的不同溶出率Rd，1)～3)组的Rd分别为45.5％，41.5％，26.0％；通过差减法计算得到溶出有机硒Do，Do＝Dt-Di，1)～3)组的Do分别为357.4μg/g干重，328.4μg/g干重，198.8μg/g干重；最后利用总硒溶出率Dt矫正酵母细胞中的有机硒含量O，O＝Do/Dt，1)～3)组的有机硒含量O分别为786.1μg/g干重，792.2μg/g干重，763.3μg/g干重。通过公式Po＝O/T计算得到不同破碎条件下有机硒在总硒中的比例，1)～3)组测得的有机硒占总硒比例分别为85.1％，84.9％，84.6％。

用破碎率更低的冻融法破碎酵母细胞，分别测定了富硒酵母中通过总硒溶出率Rd矫正的有机硒含量O与未矫正的有机硒含量即溶出有机硒含量Do，测定结果如图3所示。从图3可得出，矫正前各组有机测定结果均低于矫正后各组有机测定结果，各组之间存在显著性差异，组间RSD＝29％，远大于优良实验标准RSD≤3％，证明改良前有机硒测定结果的误差是由于破碎不完全导致的；通过Rd矫正后的各组有机硒测定结果间无显著性差异，且组间RSD＝0.3％<3％，符合优良实验条件，说明本发明酵母中有机硒测定方法在酵母细胞破碎率很低的条件下测定结果依然准确可靠，再次证明本发明所述的有机硒测定方法不受破碎条件影响。

实施例4

1.酵母总硒T测定

取富硒酵母干粉1g，采用GB 5009.93-2017中的第一法氢化物原子荧光光谱法测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量，T＝955.7μg/g干重。

2.细胞破碎

配制质量浓度分数10％的酵母细胞母液，取6组(编号1)～6))1mL分别采用超声破碎和超高压破碎法破碎细胞，超声条件分别为1500J，900J，300J，超高压破碎条件分别为15kMPa，10kMPa，7.5kMPa。

3.溶出总硒Dt测定

取上述破碎后的酵母细胞裂解液，400×g离心10min去除未破碎细胞，收集上清，采用GB 5009.93-2017中的第一法氢化物原子荧光光谱法分别测定酵母细胞溶出总硒Dt，1)～6)组的测定结果分别为830.3μg/g干重，654.3μg/g干重，483.2μg/g干重，466.4μg/g干重，445.2μg/g干重，358.5μg/g干重。

4.有机硒和无机硒的分离

各取上述上清液1mL，加入终浓度为2％的SDS混匀充分反应10min，1000×g离心1min去除SDS和大分子蛋白沉淀；收集上清，加入终浓度为1mol/L的KCl溶液反应10min，1000×g离心去除钾盐沉淀的SDS；收集上清加去离子水定容至10mL并移至分液漏斗中，加入环己烷10mL，充分震荡反应10min，去除有机相，重复多次萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准。

5.溶出无机硒Di的测定

收集步骤4中萃取后的水相，利用GB 5009.93-2017中的第一法氢化物原子荧光光谱法分别测定其中的硒含量，即为溶出无机硒Di，1)～6)组的测定结果分别为124.0μg/g干重，98.8μg/g干重，74.2μg/g干重，83.9μg/g干重，78.8μg/g干重，63.3μg/g干重。

6.有机硒(O)及其占总硒比(Po)的计算

利用测得的酵母总硒T，溶出总硒Dt，根据溶出率计算公式即Rd＝Dt/T，计算出不同破碎条件下的不同溶出率Rd，其在数值上等于细胞破碎率，1)～6)组的Rd分别为86.9％，68.5％，50.6％，48.8％，46.6％，37.5％；通过差减法计算得到溶出有机硒Do，Do＝Dt-Di，1)～6)组的Do分别为706.3μg/g干重，555.5μg/g干重，409.0μg/g干重，382.5μg/g干重，366.4μg/g干重，295.2μg/g干重；最后利用总硒溶出率Dt矫正酵母细胞中的有机硒含量O，O＝Do/Dt，1)～6)组的有机硒含量O分别为813.0μg/g干重，811.4μg/g干重，809.0μg/g干重，783.8μg/g干重，786.5μg/g干重，787.0μg/g干重。通过公式Po＝O/T计算得到不同破碎条件下有机硒在总硒中的比例，1)～6)组测得的有机硒占总硒比例分别为85.1％，84.9％，84.6％，82.0％，82.3％，82.3％。

比较富硒酵母中通过总硒溶出率Rd矫正的有机硒含量O与酵母细胞破碎率之间的关系，结果如图4所示，其中1，2，3分别为超声破碎条件1500J，900J，300J；4，5，6分别为超高压破碎条件15kMPa，10kMPa，7.5kMPa。从图4可得出，通过总硒溶出率Rd矫正的有机硒含量O测定结果间无显著性差异，组间RSD为2％<3％，满足优良实验条件，且与不同破碎方式和破碎条件下的破碎率无关，表明本发明方法酵母中有机硒测定结果与酵母细胞的破碎率无关，利用本发明方法能够测定任一破碎方式和条件下酵母细胞中的有机硒含量。

实施例5

1.酵母总硒T测定

取富硒酵母干粉1g，采用GB 5009.93-2017中的第一法氢化物原子荧光光谱法测定酵母细胞破碎前酵母中总硒含量，T＝955.7μg/g干重。

2.细胞破碎

配制质量分数10％的酵母细胞母液，取3组1mL放入液氮中冷冻10min，取出后迅速放入微波炉中解冻5min，微波炉功率750W，重复5次。

3.溶出总硒Dt测定

取上述破碎后的酵母细胞裂解液，400×g离心10min去除未破碎细胞，收集上清，利用总硒T的测定方法测定酵母细胞溶出总硒Dt，Dt＝434.5μg/g干重。

4.有机硒和无机硒的分离

取上述上清液1mL，加入终浓度为2％的SDS混匀充分反应10min，1000×g离心1min去除SDS和大分子蛋白沉淀；收集上清，加入终浓度为1mol/L的KCl溶液反应10min，1000×g离心去除钾盐沉淀的SDS；收集上清加去离子水定容至10mL并移至分液漏斗中，加入环己烷10mL，充分震荡反应10min，去除有机相，重复多次萃取，直至环己烷相与水相之间界面清晰狭窄无白色絮凝沉淀为准。

5.溶出无机硒Di的测定

收集步骤4中萃取后的水相，采用GB 5009.93-2017中的第一法氢化物原子荧光光谱法测定其中硒含量，即为溶出无机硒Di，Di＝77.1μg/g干重。

6.总硒溶出率Rd的计算

利用测得的酵母总硒T，溶出总硒Dt，根据溶出率计算公式即Rd＝Dt/T，计算出总硒溶出率Rd＝45.5％。

7.加样回收率测定

分别取质量分数10％的酵母细胞母液1mL于3支离心管中，分别加入Na2SeO3标准样209.83，269.78，323.74μg/g酵母干粉。采用步骤2～5的方法测定溶出无机硒含量Di，3组无机硒含量Di测定结果分别为165.4μg/g干重，186.4μg/g干重，213.6μg/g干重；根据公式I＝Di/Dt，计算矫正后的无机硒含量I，3组计算结果分别为376.5μg/g干重，424.4μg/g干重，486.38μg/g干重；最后根据公式加样回收率＝(加样试样测定值-试样测定值)÷加样量×100％，计算加样回收率，结果如表1所示：

表1冻融5次破碎酵母测无机硒样回收率

平均回收率为94％。

由表1的测定结果得到平均回收率94％，远高于国家标准的80％，且RSD为1.8％＜3％，偏差小，达到优良实验所具备的条件。证明即便利用破碎率最低的冻融方法破碎酵母细胞，通过本发明方法测定有机硒含量也准确可靠。

以上结果表明，改良后的酵母中有机硒含量与破碎程度无关，说明Rd的引入矫正了因为细胞破碎不彻底导致的测定误差；同时利用破碎率很低的冻融法破碎酵母细胞验证有机硒测定结果得到的酵母有机硒结果准确，精准度高，证明了改良后有机硒测定结果准确可靠并且不受破碎条件的影响。

综上所述，本发明提出用总硒溶出率Rd替代细胞裂解率，解决了细胞破碎率难以测定的问题，同时给出了细胞中有机硒和无机硒有效分离的方法。本发明提供的有机硒测定结果准确且不受破碎方式和破碎条件影响，说明Rd的引入矫正了因为细胞破碎不彻底导致的测定误差。

以上给出的实施例是实现本发明部分举例，本发明不限于上述实施例。本领域的技术人员根据本发明技术方案的技术特征所做出的任何非本质的添加、替换，均属于本发明的保护范围。